Smad串話JNK信號(hào)通路在BMP-9誘導(dǎo)PDLSCs成骨分化過程中作用與機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:
　　牙周炎是影響口腔健康導(dǎo)致失牙的主要原因，傳統(tǒng)的治療方案僅能改善牙周環(huán)境難以修復(fù)牙周炎引起的牙槽骨缺損。牙周組織工程通過構(gòu)建細(xì)胞和多種材料的復(fù)合體并移植于牙槽骨缺損處，起到重建牙周組織、治療疾病的作用。牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)是牙周膜中具有自我增殖與多向分化潛能的干細(xì)胞，運(yùn)用于牙周組織工程可顯著增強(qiáng)牙周組織的形成和修復(fù)能力。骨形態(tài)發(fā)生蛋白9(bone

2、 morphogenetic proteins-9，BMP9)是優(yōu)秀的成骨生長(zhǎng)因子，已證實(shí)其具有較好的促干細(xì)胞成骨分化的能力，但對(duì)其作用機(jī)制尚不明確。有學(xué)者提出BMP9的作用機(jī)制包含Smad蛋白(drosophila mothers against decapentaplegic proteins，Smads)傳遞信號(hào)為主的BMPs-Smad經(jīng)典通路，以及通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kin

3、ases，MAPK)傳遞信號(hào)的BMPs-MAPK非經(jīng)典途徑，其中BMPs-Smad經(jīng)典通路已獲得學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)可，但對(duì)于BMPs-MAPK途徑尚處于探索和初級(jí)研究階段。MAPK通路下游底物與骨生長(zhǎng)發(fā)育并沒有直接關(guān)系，但有研究報(bào)道部分MAPK家族成員參與BMPs促成骨分化，因此猜測(cè)MAPK是通過串話其他通路參與BMPs誘導(dǎo)成骨的過程。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)作為MAPK家族重要成員，尚

4、沒有在BMP9促進(jìn)成骨分化的作用和機(jī)制中有研究報(bào)道。此前有學(xué)者證實(shí)JNK與Smad2/3蛋白可以發(fā)生相互作用，這為兩條通路的串話提供了前提，但是目前為止，尚未有JNK通路和Smad2/3通路在BMP9誘導(dǎo)PDLSCs成骨分化過程中是否發(fā)生串話以及如何發(fā)生串話的文獻(xiàn)報(bào)道。為了明確JNK通路是否在BMP9誘導(dǎo)PDLSCs成骨分化過程中發(fā)揮作用，以及JNK通路是否串話Smad信號(hào)通路，如何進(jìn)行串話等問題，本項(xiàng)課題將深入研究討論。
　　研

5、究方法:
　　1.從牙周膜組織中通過改良組織塊貼壁法獲取離體細(xì)胞，通過CD146免疫磁珠分選獲取PDLSCs，之后進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)志物鑒定、組織來源鑒定、成骨分化和成脂分化能力鑒定。
　　2.構(gòu)建過表達(dá)Ad-BMP9載體，檢測(cè)其對(duì)PDLSCs合適的感染劑量(multiplicities of infection，MOI)后誘導(dǎo)PDLSCs成骨分化，檢測(cè)BMP9、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcri

6、ption factor2，Runx2)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、骨鈣蛋白(osteoclain，OCN)等成骨基因蛋白的表達(dá)情況和ALP活性等指標(biāo)，分析BMP9促進(jìn)PDLSCs成骨分化的能力。
　　3.通過SP600125和AdR-si-JNK抑制或干擾JNK通路，驗(yàn)證干擾效果后，檢測(cè)Runx2、ALP、OPN、OCN等成骨基因蛋白的表達(dá)情況和A

7、LP活性、鈣鹽結(jié)節(jié)沉積量等指標(biāo)，判斷JNK通路是否參與BMP9誘導(dǎo)PDLSCs成骨分化。通過抑制或干擾JNK通路，檢測(cè)Smad2/3和p-Samd2/3的蛋白表達(dá)，判斷JNK通路是否與Smad通路有密切關(guān)系，最后通過免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）檢測(cè)p-JNK是否與Smad2/3發(fā)生反應(yīng)。綜合分析后，判斷JNK通路是否串話Smad通路并在BMP9誘導(dǎo)PDLSCs成骨分化過程中發(fā)揮作用。
　　

8、4.向裸鼠肌肉內(nèi)移植過表達(dá)BMP9的PDLSCs，使用腺病毒干擾JNK通路，通過影像學(xué)和HE染色對(duì)比未干擾JNK通路裸鼠異位成骨狀態(tài)，鑒定分析JNK通路對(duì)BMP9誘導(dǎo)PDLSCs體內(nèi)成骨的影響。
　　研究結(jié)果和結(jié)論:
　　1.經(jīng)磁珠分選所得的細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CD146陽性和STRO-1陽性比例約占27.9％;免疫熒光染色顯示角蛋白陰性、波形蛋白陽性，表示細(xì)胞為中胚層來源的間充質(zhì)細(xì)胞，且無外胚層來源細(xì)胞的污染;茜素紅S染色和油紅O

9、檢測(cè)表明分選后細(xì)胞具有成骨和成脂的多向分化潛能。
　　2.熒光表達(dá)顯示Ad-BMP9感染PDLSCs的MOI值為30-60，感染之后BMP9基因蛋白明顯增高，表明構(gòu)建的腺病毒有效;此外Runx2、ALP、OPN、OCN等成骨基因蛋白和ALP活性均較對(duì)照組明顯增高，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明BMP9具有誘導(dǎo)PDLSCs成骨分化的作用。
　　3.分別抑制或干擾JNK通路后，p-JNK蛋白表達(dá)下降，證實(shí)JNK通路受到影響;干擾之后R

10、unx2、ALP、OPN、OCN等成骨基因蛋白的表達(dá)情況和ALP活性、鈣鹽結(jié)節(jié)沉積量等指標(biāo)均有不同程度下降，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明JNK通路參與BMP9誘導(dǎo)PDLSCs成骨分化;此外p-Smad的蛋白也隨著JNK通路被干擾而表達(dá)下降，證實(shí)JNK通路與Smad通路關(guān)系密切，最后通過Co-IP檢測(cè)證實(shí)p-JNK和Smad2/3存在相互作用，結(jié)果表明JNK通路是通過串話Smad通路參與BMP9誘導(dǎo)PDLSCs成骨分化的過程。
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