細(xì)葉百合鱗莖休眠解除過(guò)程的生物學(xué)分析.pdf

1、百合是世界各國(guó)人們都喜愛(ài)的球根花卉，鱗莖秋季收獲后便進(jìn)入自然休眠的狀態(tài)。需要經(jīng)過(guò)一段時(shí)期的低溫處理才會(huì)徹底解除休眠保證第二年正常開(kāi)花生長(zhǎng)。鱗莖休眠的解除是一個(gè)復(fù)雜的生物過(guò)程。激素、碳水化合物與內(nèi)外環(huán)境因子及遺傳基因等構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)調(diào)控著休眠的整個(gè)過(guò)程。百合鱗莖休眠的研究目前主要集中在低溫解除休眠過(guò)程中的形態(tài)變化和生理生化變化方面，而分子水平的研究甚少。本研究以細(xì)葉百合（Lilium pumilum）為試材，5℃低溫解除休眠過(guò)程中，在

2、對(duì)百合鱗莖休眠的細(xì)胞學(xué)及生理學(xué)研究的基礎(chǔ)上，利用分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建了百合鱗莖休眠解除過(guò)程中的抑制差減cDNA文庫(kù)，獲得大量與休眠調(diào)控相關(guān)的基因，并利用雙向電泳技術(shù)手段來(lái)研究和分析細(xì)葉百合鱗莖通過(guò)低溫解除休眠過(guò)程中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)及其調(diào)控功能，以期為進(jìn)一步研究鱗莖休眠機(jī)制奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　1、通過(guò)石蠟切片和實(shí)體顯微結(jié)構(gòu)觀察，低溫冷藏期間，細(xì)葉百合花芽分化主要分為小花原基分化期，外輪花被原基分化期，內(nèi)輪花被原基分化期

3、，雄蕊和雌蕊原基分化期四個(gè)時(shí)期。鱗片及頂芽細(xì)胞內(nèi)淀粉粒數(shù)量逐漸減少。冷藏36 d以后細(xì)胞分裂數(shù)量逐漸增加。透射電鏡觀察表明，低溫處理0～12 d，鱗莖物質(zhì)和能量代謝較弱，鱗莖不能萌發(fā);12～48 d鱗莖萌發(fā)率較低，線粒體及高爾基體分泌囊泡增多，細(xì)胞通過(guò)質(zhì)膜內(nèi)吞及胞間連絲進(jìn)行物質(zhì)交流;48～72 d，核仁松散，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有序排列，在液泡膜與質(zhì)膜邊緣形成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)橋，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)橋一直延伸到核膜方向，胞內(nèi)及胞間聯(lián)系已經(jīng)建立，鱗莖出現(xiàn)新生根;冷藏84 d時(shí)

4、頂芽已伸長(zhǎng)到鱗莖頂端。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)橋延伸到胞間連絲，細(xì)胞器內(nèi)部結(jié)構(gòu)及數(shù)量增加，休眠完全打破。冷藏過(guò)程中百合鱗莖的頂芽隨冷藏時(shí)間的推移漸漸伸長(zhǎng)，呼吸速率呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。冷藏時(shí)間越長(zhǎng)，鱗莖萌發(fā)時(shí)間越短。
　　2、在細(xì)葉百合鱗莖低溫貯藏過(guò)程中，項(xiàng)芽與鱗莖盤(pán)中的核酸含量發(fā)生了明顯的變化，項(xiàng)芽分生組織中DNA、RNA含量及RNA/DNA的比值在鱗莖冷藏36 d時(shí)變化最為明顯，貯藏36 d是內(nèi)外鱗片DNA及核酸總含量的轉(zhuǎn)折點(diǎn)。頂芽和鱗莖盤(pán)冷

5、藏0～36 d內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)的含量升高，鱗莖不同部位可溶性蛋白質(zhì)含量在冷藏48 d后迅速降低也是鱗莖開(kāi)始解除休眠的重要體現(xiàn)。鱗莖休眠解除過(guò)程中伴隨著旺盛的糖類(lèi)代謝活動(dòng)，淀粉含量下降，淀粉酶活性升高。貯藏前期，蔗糖含量，蔗糖代謝關(guān)鍵酶SS和SPS活性上升，SPS和SS協(xié)同控制蔗糖代謝及轉(zhuǎn)運(yùn)。冷藏條件下鱗片及項(xiàng)芽?jī)?nèi)淀粉向可溶性糖方向代謝過(guò)程中促進(jìn)了AGPase活性的增加。AGPase可能是休眠打破的一個(gè)重要的生理決定因素。鱗片、頂芽及鱗莖盤(pán)

6、SOD、POD、CAT活性在冷藏前期下降，冷藏中后期，SOD、CAT、ASP活性升高，鱗片中POD的活性下降，項(xiàng)芽及鱗莖盤(pán)POD、PPO在冷藏中期上升。各種代謝相關(guān)酶在不同器官中的作用并不完全相同。36 d是鱗莖解除休眠的起點(diǎn)，60 d時(shí)鱗莖基本解除休眠。
　　3、利用抑制消減雜交技術(shù)構(gòu)建了細(xì)葉百合鱗莖休眠及解除正、反向抑制消減文庫(kù)。對(duì)正、反向文庫(kù)隨機(jī)挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序各獲得100個(gè)表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)，在NCBI上進(jìn)行BLAST

7、x分析并用KOBAS系統(tǒng)將獲得的unigene定位到Pathways中。分析結(jié)果表明，差異基因GO功能主要富集在蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞抗性及防御過(guò)程、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、結(jié)合活性、轉(zhuǎn)錄活性、代謝過(guò)程等。休眠文庫(kù)ESTs功能主要涉及脅迫響應(yīng)方面，苯丙素生物合成及苯丙氨酸代謝途徑，促分裂素原活化蛋白激酶/MAPK激酶及抗壞血酸代謝途徑等與休眠有關(guān)。休眠解除文庫(kù)在糖代謝、激素響應(yīng)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面表達(dá)量較高，淀粉及蔗糖代謝途徑、α-亞麻酸代謝、亞油酸代謝途徑、甲

8、硫氨酸和半胱氨酸等氨基酸代謝途徑、磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)等參與了休眠解除過(guò)程。選取了8個(gè)差異表達(dá)基因用Real-time PCR檢測(cè)分析，這些基因在百合鱗莖休眠解除過(guò)程中大部分上調(diào)表達(dá)。
　　4、利用熒光差異凝膠電泳分離得到31個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)。相對(duì)于休眠鱗莖，休眠解除鱗莖中上調(diào)表達(dá)的蛋白點(diǎn)有14個(gè)，占總數(shù)的45.16％;下調(diào)表達(dá)的蛋白點(diǎn)有17個(gè)，占總數(shù)的54.84％;應(yīng)用MS質(zhì)譜成功鑒定12個(gè)差異蛋白點(diǎn)，按功能劃分為6類(lèi)，分析表明，