馬尾藻多糖的分離純化、生物活性及結(jié)構(gòu)分析.pdf

1、馬尾藻(Sargassum pallidum)屬褐藻門馬尾藻科植物，盛產(chǎn)于我國黃海、渤海沿岸各地，資源十分豐富，由于不能直接食用，以致目前馬尾藻的加工利用范圍比較窄，只有小部分被用作飼料、藻膠和醫(yī)藥工業(yè)的原料，大部分尚未得到全面的開發(fā)利用。褐藻糖膠(褐藻多糖)是褐藻中的一種雜多糖，具有多樣的生理功能，是褐藻中重要的生物活性物質(zhì)。目前國內(nèi)外對馬尾藻中的多糖(S.pallidum Polysaccharides，SPP)研究很少，且不夠深入

2、.鑒于此，本文對采自山東榮成的馬尾藻中多糖的體外抗腫瘤活性與體外抗氧化活性，以及多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，以期了解它們的生理活性與結(jié)構(gòu). 本論文共有四個部分，分別對馬尾藻多糖的提取、分離純化和理化性質(zhì)、體外抗腫瘤活性與抗氧化活性、結(jié)構(gòu)鑒定進(jìn)行了研究。主要結(jié)果如下： 1.馬尾藻多糖的提取 利用超臨界二氧化碳(SC-CO2)脫除馬尾藻粉中的脂類物質(zhì)，研究了超臨界CO2萃取壓力、萃取溫度、萃取時間對馬尾藻脫脂過程的影響。研

3、究結(jié)果表明CO2的流量為20 L/h時，超臨界CO2脫脂的最佳工藝條件為：萃取壓力45 MPa，萃取溫度55℃，時間6h，萃取率為8.53‰。 將響應(yīng)面分析法用于馬尾藻多糖的提取工藝，對影響馬尾藻多糖提取的主要因素超聲波破碎時間、提取溫度、提取時間的最佳水平范圍及其交互作用進(jìn)行了研究和探討，依據(jù)回歸分析結(jié)果，最佳工藝條件是：超聲波破碎時間為469.54 s，提取溫度為90.94℃，提取時間為4.96h，多糖得率的理論值為2.48

4、％.對三氯乙酸(TCA)脫蛋白條件進(jìn)行了優(yōu)化，選擇TCA終濃度為2％左右，TCA沉淀蛋白的時間為2h或稍長. 在壓力0.5 MPa，溫度20℃下，對脫蛋白后的提取液進(jìn)行膜分離，提取液依次用孔徑0.1μm的微濾膜、截留分子量為100 KDa、50 KDa、10 KDa和3KDa的超濾膜進(jìn)行膜分離。研究結(jié)果表明多糖組分主要包含在分子量大于50 KDa的截流液中，由于大于孔徑0.1μm的截流溶液中所含多糖量較多，成分較復(fù)雜，將其單獨收

5、集分析。分子量小于50 KDa的溶液多糖含量較少，將其合并。在以后的實驗中將SPP提取液分成三部分SPP-1(>0.1μm)、SPP-2(<0.1μm且>50 KDa)和SPP-3(<50 KDa)。 研究了馬尾藻料液濃度對膜分離的影響，在料液比分別為1:20(m/V)、1:30、1:100、1:150，壓力為0.5 MPa，溫度為20℃時，將脫蛋白后的提取液進(jìn)行膜分離，結(jié)果表明隨著料液比的增加，膜分離后的多糖損失越少.綜合考慮

6、，在膜分離前將待處理的溶液按1:150稀釋.在溫度20℃時，壓力分別在0.1、0.3、0.5 MPa下進(jìn)行膜分離，結(jié)果表明操作壓力對多糖損失并無顯著影響，在膜分離設(shè)備允許壓力范圍內(nèi)，0.1-0.5 MPa都是適合的. 2.馬尾藻多糖的純化 多糖組分SPP-1、SPP-2和SPP-3占粗多糖百分比分別為72.15％、16.69％和11.16％，其中的多糖含量依次為58.13％、18.98％和16.38％，蛋白含量依次為1.

7、09％、1.75％和1.73％，硫酸基含量依次為15.68％、15.26％和22.62％，糖醛酸含量依次為14.22％、14.30％和5.20％. 利用DEAE Cellulose-52層析柱分別對SPP-1、SPP-2和SPP-3三個多糖組分進(jìn)行分離純化，其中由SPP-1得到兩個主要的組分SPP-1-1和SPP-1-2，得率分別為32.53％和8.67％；由SPP-2得到SPP-2-1、SPP-2-2和SPP-2-3三個組分，

8、得率分別為10.53％、9.20％和36.33％；由SPP-3得到SPP-3-1和SPP-3-2兩個組分，得率分別19.52％和57.27％.在純化過程中多糖有部分損失，同時粗多糖中的蛋白基本被除去。利用Sephadex G-100層析柱分別對SPP-1-1、SPP-1-2、SPP-2-1、SPP-2-2、SPP-2-3、SPP-3-1和SPP-3-2七個組分進(jìn)行分離純化，以用于進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)分析。 3.馬尾藻多糖的體外抗腫瘤活性

9、與抗氧化活性 以MTT比色法探討了經(jīng)DEAE Cellulose-52純化得到的七個多糖組分對人肺癌細(xì)胞株A549、人肝癌細(xì)胞株HepG2和人胃癌細(xì)胞株MGC-803生長的體外抑制作用。組分SPP-3-1和SPP-3-2對人肝癌細(xì)胞株HepG2、人肺癌細(xì)胞株A549和人胃癌細(xì)胞株MGC-803的生長具有明顯的體外抑制作用，且抑制能力具有劑量依賴性。組分SPP-2-3只對肝癌HepG2細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)抑制率，并呈劑量依賴性，組分SPP

10、-3-1和SPP-3-2具有較高的體外抗腫瘤活性可能與它們的低分子量(<50 KDa)及高硫酸基含量(22.62％)有關(guān)。 在濃度為2 mg/mL時，粗多糖組分SPP-1、SPP-2和SPP-3對DPPH自由基的清除率分別為23.84％、13.23％和12.83％；總抗氧化能力分別為0.087、0.083和0.088(μmolFeSO4/mg)；還原力(以700 nm處的吸光度A700表示)分別為0.785、0.446和0.54

11、1；對·OH的清除率分別為68.39％、13.22％和27.59％。 研究了乙醇浸提溫度對馬尾藻中總多酚含量的影響，在30℃馬尾藻中的多酚類物質(zhì)不能完全浸提出來；在70℃因浸出時間短不易控制，所以選擇50℃作為乙醇浸提溫度。馬尾藻經(jīng)50℃、70％乙醇浸提后，依次用不同有機(jī)溶劑萃取后得到乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及萃取剩余物，其占總萃取物百分比依次為15.76％、5.28％、78.96％，采用Folin-Ciocalteu比色法

12、測定其中的總多酚含量，以綠原酸(CHA)作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，依次為3.20 mgCHA/g干重、12.12 mgCHA/g干重和52.08 mgCHA/g干重，總萃取物得率為8.07％。 乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物在濃度為2 mg/mL時對DPPH自由基清除率分別為30.59％和29.36％。乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物的總抗氧化能力較高，分別為0.520和0.345(μmolFeSO4/mg).乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和萃取剩

13、余物的還原力較高，由高到低為萃取剩余物>正丁醇萃取物>乙酸乙酯萃取物。乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和萃取剩余物在濃度為2 mg/mL時對金屬離子的螯合率分別為48.25％、51.34％和17.21％。 4.馬尾藻活性多糖的結(jié)構(gòu)分析 利用高效凝膠過濾色譜法(HPGFC)測定多糖組分SPP-2-3、SPP-3-1、SPP-3-2的分子量和檢測其純度，其平均分子量(Mw)依次為132.999 KDa、5.874 KDa、7.2

14、49KDa.氣相色譜法分析多糖的單糖組成，SPP-2-3單糖組成及摩爾比為鼠李糖:木糖:巖藻糖:甘露糖:葡萄糖:半乳糖=0.15:2.74:0.64:1.00:0.49:1.11，SPP-3-1單糖組成及摩爾比為甘露糖:葡萄糖:半乳糖=1.00:11.18:0.96，SPP-3-2單糖組成及摩爾比為鼠李糖:木糖:巖藻糖:甘露糖:葡萄糖:半乳糖=0.17:2.53:0.61:1.00:0.46:0，92。通過紅外吸收光譜(IR)分析得知S

15、PP-2-3和SPP-3-2中存在□糖苷鍵。 高碘酸氧化、Smith降解以及甲基化分析結(jié)果顯示SPP-2-3中的甘露糖的連接方式以(1→3)糖苷鍵為主，葡萄糖和半乳糖除了存在(1→3)鍵型外，還存在(1→6)鍵連接方式；木糖的連接方式以(1→2)鍵為主；巖藻糖除了存在(1→3)鍵型外，還存在(1→4)鍵型。SPP-3-2中的甘露糖和半乳糖的連接方式以(1→3)鍵為主；葡萄糖是以(1→6)或者(1→2)鍵型連接；木糖和巖藻糖以(1