家蠶幾種尿苷二磷酸-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的基因表達與功能研究.pdf

1、家蠶(Bombyx mori)天然有色蠶繭分為紅黃繭系和黃綠繭系兩大類。決定黃紅繭系繭色的色素主要來自桑葉中的胡蘿卜素(β-胡蘿卜素、新生β-胡蘿卜素等)和葉黃素類色素(葉黃素、蒲公英黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、次黃嘌呤黃質(zhì)等),而黃綠繭系的色素主要為黃酮類化合物。家蠶從桑葉中攝入的黃酮類化合物,需要在體內(nèi)進行化學(xué)修飾之后方能顯現(xiàn)出綠繭色,但綠繭色的形成以及黃酮類色素的化學(xué)修飾分子機理,特別是基因調(diào)控機理目前還不清楚。
　　 尿苷二磷酸.葡萄

2、糖基轉(zhuǎn)移酶(UGTs)是一群廣泛分布于動物、植物、細菌以及病毒,與糖基化有關(guān)的蛋白酶超家族。該類酶催化核苷酸的糖基轉(zhuǎn)移到受體分子的糖苷配基上,從而使受體分子從疏水性轉(zhuǎn)變成親水性。昆蟲利用UGT酶的糖基化作用降解食物中的有毒植物化學(xué)物質(zhì),以抵抗食物有毒成分對機體造成的危害,UGT酶甚至還與殺蟲劑的抗藥性有關(guān)。
　　 家蠶等昆蟲從植物攝取的黃酮類化合物在體內(nèi)需要經(jīng)過一系列如UGT酶參與的糖基化作用等化學(xué)修飾,而家蠶繭層中的黃酮類化合

3、物分子結(jié)構(gòu)也與桑葉中的黃酮類化合物明顯不同,家蠶從桑葉攝取的一類黃酮類化合物槲皮素,先在中腸生成5.氧糖苷槲皮素,后在絲腺生成4’5’-雙氧糖苷槲皮素。已知家蠶綠色繭的繭色形成主要由黃酮化合物的含量所決定,可以推測,UGT酶的基因家族可能與黃酮類色素在家蠶體內(nèi)的轉(zhuǎn)移,以及蠶繭的成色有關(guān)。
　　 家蠶是鱗翅目模式生物,其天然有色繭是具有重大應(yīng)用前景的遺傳資源。由于家蠶繭色受多基因調(diào)控,遺傳機制了解不詳,挖掘和研究繭色調(diào)控基因是被公

4、認的有效突破口之一。本文依靠家蠶基因組數(shù)據(jù)庫資源,利用分子克隆、RACE、RNAi、bac-to-bac昆蟲細胞表達等技術(shù)手段,對鱗翅目模式昆蟲家蠶的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因的表達模式和功能進行了研究,希望進一步揭示UGT基因的功能,以及家蠶繭色的形成機理,為繭色分子標(biāo)記和分子設(shè)計育種提供幫助,主要結(jié)果如下:
　　 1.首次在家蠶中克隆出4種尚未克隆的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因,包括UGT013830(UGT30)、UGT013834(UGT

5、34)、UGTO13859(UGT59)、UGT013860(UGT60)基因。利用RACE技術(shù)成功的克隆出UGT30基因的全長cDNA,其長度為2136bp(登錄號為:HQ833816)。根據(jù)已有報道,選取了7種在中腸和絲腺中表達量較高的UGT基因,包括UGT30、UGT34、UGT59、UGT60、UGT013865(UGT65)、UGT010286(UGT86)和UGT010289(UGT89),對其中一些基因做了時空表達的調(diào)查。

6、
　　 2.為了研究UGT酶對家蠶繭色的影響,用RT-PCR方法對以上7種基因在白繭品種C108和皓月、綠繭品種火造和G1、黃繭品種Y12和黃繭限性品種Ys的絲腺、中腸和生殖腺組織中的表達進行了定性與定量分析。結(jié)果顯示,UGT30、UGT86和UGT89具有綠繭品種特異性表達,可能與綠繭色形成有關(guān),而UGT30在不同繭色品種還存在mRNA轉(zhuǎn)錄本的差異。
　　 3.進一步闡明這些UGT基因的作用,我們選取了UG730,具有

7、綠繭品種特異性表達的基因,以體外轉(zhuǎn)錄合成長鏈dsRNA,并優(yōu)化了注射家蠶體內(nèi)的濃度。由于dsRNA注射的有效時間是36-72 h,我們采取在大造品種5齡期間共兩次注射5μg／dsRNA。家蠶在注射dsRNA UGT30后,出現(xiàn)死亡率增加、發(fā)育變緩?？赡苁怯捎诩倚Q發(fā)育過程中UGT30蛋白對于物質(zhì)在體內(nèi)代謝的起到重要的作用,UG730基因表達量下調(diào)將導(dǎo)致家蠶體質(zhì)變?nèi)?不能正常生長。另外,檢測注射前后絲腺和中腸總黃酮含量,結(jié)果顯示總黃酮含量在

8、注射前后幾乎未發(fā)生改變。而后我們又采用Real time PCR方法,選取了UGT30和UGT86基因,對家蠶5齡幼蟲不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平以及蛻皮激素和植物次生代謝物誘導(dǎo)下5齡幼蟲不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平進行了測定。
　　 4.以Bac-to-Bac桿狀病毒感染的Sf9昆蟲表達系統(tǒng)獲得了大量高活性UGT86和UGT30重組蛋白；將重組后的粘粒與陽離子脂質(zhì)體結(jié)合后轉(zhuǎn)染Sf9細胞,獲得重組桿狀病毒,感染Sf9細胞72h后收集蛋白,采用R