里氏木霉纖維二糖水解酶Ⅱ基因的克隆與表達(dá).pdf

1、纖維二糖水解酶是能夠高效降解木質(zhì)纖維素的里氏木霉纖維素酶的重要組分之一，是纖維素酶催化水解結(jié)晶區(qū)纖維素的關(guān)鍵。本文從里氏木霉（Trichoderma reesei）ZU-02中克隆出了cbh2基因，并研究其在大腸桿菌、畢赤酵母、里氏木霉中的表達(dá)。
　　采用反轉(zhuǎn)錄PCR獲得里氏木霉cbh2基因，用其構(gòu)建重組載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌。IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)酶結(jié)果表明:里氏木霉cbh2基因已在大腸桿菌中成功實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)表達(dá)。
　　分別采用里氏木霉c

2、bh2基因和經(jīng)過密碼子優(yōu)化的cbh2s基因構(gòu)建重組載體，并在畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)。篩選獲得2株優(yōu)良轉(zhuǎn)化子，分別包含cbh2(PC-1)和cbh2s(PC-2)。發(fā)酵液SDS-PAGE結(jié)果顯示在約58 kDa處有單一明顯條帶，為重組CBHⅡ，即cbh2基因在畢赤酵母中的表達(dá)產(chǎn)物，其中包含了約5 kDa的糖基化。
　　對(duì)轉(zhuǎn)化子PC-1和PC-2的產(chǎn)酶性能進(jìn)行了比較實(shí)驗(yàn)，誘導(dǎo)發(fā)酵96 h，PC-2的纖維二糖水解酶活力是PC-1的2.02倍

3、，PC-2的可溶性蛋白是PC-1的1.66倍。研究結(jié)果表明:密碼子優(yōu)化策略促進(jìn)了里氏木霉cbh2基因在畢赤酵母中的異源表達(dá)。
　　研究了重組畢赤酵母所產(chǎn)CBHⅡ的最適pH與最適溫度，分別是5.0和50℃。模擬了CBHⅡ的CBD和CD區(qū)域的三維模型。
　　為了提高里氏木霉纖維素酶的協(xié)同降解能力，將cbh2基因置于里氏木霉的強(qiáng)啟動(dòng)子Pcbh1及其信號(hào)肽下游，并進(jìn)一步以pCAMBIA1300為載體骨架，構(gòu)建成含潮霉素B抗性標(biāo)記的重

4、組質(zhì)粒pCAMBIA1300-hph-PsCT。采用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入里氏木霉宿主細(xì)胞。優(yōu)化了影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)里氏木霉轉(zhuǎn)化的諸因素，使得轉(zhuǎn)化率大幅提高。針對(duì)篩選里氏木霉高產(chǎn)纖維二糖水解酶轉(zhuǎn)化子的特殊要求，采用潮霉素抗性篩選與菌落在微晶纖維素平板上的生長(zhǎng)速率篩選相結(jié)合的兩步法篩選，從326個(gè)里氏木霉轉(zhuǎn)化子中篩選出10個(gè)優(yōu)良轉(zhuǎn)化子。
　　對(duì)重組里氏木霉轉(zhuǎn)化子(C10)的產(chǎn)酶性能進(jìn)行了研究，采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基和產(chǎn)酶條件。

5、搖瓶條件下發(fā)酵120 h，重組里氏木霉的內(nèi)切葡聚糖酶活力和纖維二糖酶活力與初始菌株相比沒有明顯變化，但其纖維二糖水解酶活力為122.44U/mL，是初始菌株的5.4倍。由于重組里氏木霉纖維素酶系組成中纖維二糖水解酶活力明顯提高，其纖維素酶總活力（濾紙酶活力）也提高到初始菌株的4.3倍。
　　對(duì)重組纖維素酶在木質(zhì)纖維素降解中的應(yīng)用性能進(jìn)行了研究。以初始菌株ZU-02纖維素酶為參照，在同等條件下，重組纖維素酶對(duì)玉米秸稈的酶解得率高達(dá)9