雞、鴨和犬α干擾素全基因合成、原核表達及抗病毒活性測定.pdf

1、干擾素（IFN）是在特定的誘生劑作用下由細胞產(chǎn)生的一組具有抗病毒、抗腫瘤、參與免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性的糖蛋白，分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三大類型。其中，Ⅰ型干擾素的抗病毒作用最強，對人類和動物病毒病的免疫防治等相關(guān)基礎(chǔ)性研究具有重要意義，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景.基因工程干擾素不僅與天然干擾素有高度相似的生物學(xué)活性，并且與傳統(tǒng)誘導(dǎo)淋巴細胞產(chǎn)生干擾素相比，還有純度高、適合規(guī)模化生產(chǎn)、產(chǎn)品質(zhì)量容易控制、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點，更重要的是通過大規(guī)模生產(chǎn)的基因

2、工程干擾素的成本大大降低，利于其在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中廣泛使用。本研究的目的就是利用基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)研制出重組雞、鴨和犬α干擾素并研究其抗病毒功能，為其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　 根據(jù)GeneBank上登錄的雞、鴨和犬α干擾素基因序列，去掉信號肽，保留編碼成熟蛋白的序列，按照大腸桿菌密碼子的偏好性及密碼子的兼并性，在不改變氨基酸組成和排列順序的基礎(chǔ)上，對已知的基因序列進行改造，全部替換為大腸桿菌喜好的密碼子，得到新

3、的編碼雞、鴨和犬α干擾素的基因序列，大小分別為489bp、486bp、495bp，并在序列兩端分別加上EcoRI、XhoI酶切位點，送生物公司進行全基因合成，并連入原核表達質(zhì)粒pET32a中，得到pET32a-ChIFN-α、pET32a-DuIFN-α和pET32a-CaIFN-α三個重組原核表達質(zhì)粒，經(jīng)熱轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21（DE3）中，加IPTG進行誘導(dǎo)表達，SDS-PAGE電泳顯示，三個重組原核表達質(zhì)粒均在大腸桿菌BL21（D

4、E3）中進行了高水平表達，得到三個相對分子質(zhì)量均約為32kD的干擾素融合蛋白，并以包涵體形式存在。經(jīng)細胞破碎、包涵體提取、洗滌、溶解變性及透析復(fù)性后得到較純的重組雞、鴨和犬α干擾素.
　　 利用微量細胞病變抑制法測定重組融合蛋白的抗病毒活性，結(jié)果如下：（1）利用雞胚成纖維細胞測定，重組雞α干擾素抗VSV活性為5.6x104U/mL，蛋白濃度為0.53mg/mL，比活性為1.06x105U/mg；抗NDV活性為1.35x105U/

5、mL，比活性為2.55x105U/mg。（2）利用鴨胚成纖維細胞測定，重組鴨α干擾素抗VSV活性為5.13×103U/mL，蛋白濃度為0.92 mg/mL，比活性為5.6x103U/mg。（3）利用MDCK細胞測定，重組犬α干擾素抗VSV活性為1.06x107U/mL，蛋白濃度為0.79 mg/mL，比活性為1.67x107 U/mg。
　　 對試驗雞進行新城疫人工感染的干擾素預(yù)防和治療試驗，試驗雞分成4組，1、2組分別于攻毒前