NDRG1對(duì)結(jié)直腸癌干性的影響及其調(diào)控機(jī)制.pdf

1、背景和目的：
　　眾多研究報(bào)道，N-Myc下游調(diào)控基因1（NDRG1）在不同腫瘤類(lèi)型，如結(jié)直腸癌（Colorectal cancer，CRC），前列腺癌，胰腺癌中起到抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。我們?cè)谇捌诘难芯恐邪l(fā)現(xiàn)，下調(diào)NDRG1表達(dá)能明顯促進(jìn)CRC細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換（EMT），從而增加腫瘤細(xì)胞的遷移侵襲能力。眾多研究表明，發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞可能會(huì)表現(xiàn)出不同程度的干細(xì)胞樣特征。然而NDRG1是否能抑制CRC細(xì)胞的干性尚未見(jiàn)

2、文獻(xiàn)明確報(bào)道。因此，本研究以該問(wèn)題為出發(fā)點(diǎn)，探討NDRG1對(duì)CRC干性的影響，并探討其可能的發(fā)生機(jī)制。
　　研究方法：
　　1.利用以往成功構(gòu)建并篩選的穩(wěn)定過(guò)表達(dá)NDRG1基因及穩(wěn)定沉默NDRG1基因的CRC細(xì)胞株HCT116和HT29為細(xì)胞模型。運(yùn)用上述細(xì)胞克隆，我們首先在體外實(shí)驗(yàn)中(in vitro)探究了NDRG1過(guò)表達(dá)及基因沉默對(duì)CRC細(xì)胞體外一系列“干細(xì)胞樣”表型的影響，包括一代、二代無(wú)血清成球能力、侵襲轉(zhuǎn)移能力、

3、克隆形成能力和化療耐藥性等。將HT29細(xì)胞進(jìn)行梯度稀釋后，種植于裸鼠體內(nèi)（in vivo），觀察不同NDRG1表達(dá)的HT29細(xì)胞在體內(nèi)致瘤性的差別。
　　2.體外用流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）檢測(cè)NDRG1過(guò)表達(dá)或沉默對(duì)CRC細(xì)胞表面干性分子 CD44、CD133表達(dá)的影響；用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse transcription PCR，RT-PCR）檢測(cè)不同NDRG1表達(dá)對(duì)細(xì)胞內(nèi)其它干性轉(zhuǎn)錄分子

4、（如OCT4，NANOG，SOX2，ALDH1）mRNA轉(zhuǎn)錄的影響。
　　3.免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence，IF）觀察NDRG1表達(dá)對(duì)β-catenin在細(xì)胞中定位的影響；抽提不同細(xì)胞組分蛋白（全蛋白、核蛋白、膜蛋白），WesternBlot檢測(cè)NDRG1對(duì)不同細(xì)胞組分中β-catenin表達(dá)的影響，并檢測(cè)β-catenin下游蛋白c-myc和cyclin D1的表達(dá)水平；TOP/FOP Flash assa

5、y技術(shù)檢測(cè)β-catenin轉(zhuǎn)錄活性變化，用以反映NDRG1對(duì)Wnt信號(hào)通路活性的影響。
　　4.為研究NDRG1是否通過(guò)β-catenin抑制CRC細(xì)胞的干性，我們?cè)贜DRG1穩(wěn)定下調(diào)的細(xì)胞（sh NDRG1）和對(duì)照細(xì)胞（sh Con）中干擾下調(diào)β-catenin，并在體外實(shí)驗(yàn)中觀察下調(diào)β-catenin表達(dá)后能否逆轉(zhuǎn)NDRG1低表達(dá)造成的干性增強(qiáng)的表型。
　　5.研究 NDRG1在臨床 CRC組織和相應(yīng)正常組織間的表達(dá)的

6、差異；分析NDRG1表達(dá)與 CRC臨床病理資料指標(biāo)的關(guān)系；在組織水平研究 NDRG1、β-catenin和干性分子CD44是否具有共同定位表達(dá)關(guān)系，分析其表達(dá)的相關(guān)性。
　　研究結(jié)果：
　　1.在NDRG1過(guò)表達(dá)的CRC細(xì)胞HCT116和HT29中，上述干細(xì)胞樣表型（無(wú)血清成球能力；轉(zhuǎn)移侵襲能力；克隆形成能力；化療抗性）均受到不同程度的抑制，而在穩(wěn)定下調(diào) NDRG1的細(xì)胞中，這些干性特征獲得明顯增強(qiáng)。NDRG1過(guò)表達(dá)明顯抑制

7、HT29細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的有限稀釋致瘤能力，表現(xiàn)為瘤體出現(xiàn)晚、出現(xiàn)比率低；瘤體生長(zhǎng)慢、重量輕。
　　2. NDRG1顯著下調(diào)CRC干性標(biāo)志物CD44的表達(dá)，下調(diào)NDRG1明顯增強(qiáng)CD44分子在膜上的表達(dá)，而 NDRG1對(duì)干性分子 CD133的表達(dá)無(wú)明顯影響。NDRG1過(guò)表達(dá)抑制OCT4和NANOG的轉(zhuǎn)錄，而下調(diào)NDRG1卻顯著增強(qiáng)SOX2的轉(zhuǎn)錄，NDRG1表達(dá)變化對(duì)ALDH1的轉(zhuǎn)錄無(wú)明顯影響。
　　3. NDRG1過(guò)表達(dá)能明顯

8、促進(jìn)β-catenin在細(xì)胞膜上的分布并抑制其細(xì)胞核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而抑制其轉(zhuǎn)錄活性及下游靶蛋白c-myc和cyclin D1的表達(dá)，而下調(diào)NDRG1卻表現(xiàn)出相反的特點(diǎn)。
　　4.在下調(diào)NDRG1的細(xì)胞（sh NDRG1）及對(duì)照細(xì)胞（sh Con）中同時(shí)干擾下調(diào)β-catenin（shβ-catenin）的表達(dá)后，β-catenin轉(zhuǎn)錄活性明顯降低而且靶蛋白表達(dá)減少，細(xì)胞原有的干性特征得到逆轉(zhuǎn)；而轉(zhuǎn)染shβ-catenin Con的細(xì)胞與

9、先前未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，干性表型無(wú)明顯變化。
　　5. NDRG1在正常結(jié)直腸粘膜上皮中的表達(dá)顯著強(qiáng)于在腫瘤組織中的表達(dá)；NDRG1表達(dá)陽(yáng)性CRC患者的術(shù)后五年生存率明顯高于NDRG1表達(dá)陰性的病例。而且，NDRG1表達(dá)陽(yáng)性的CRC組織多伴有核β-catenin和膜CD44的陰性表達(dá)；NDRG1表達(dá)陰性的CRC病例多伴有核β-catenin和膜CD44的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。
　　結(jié)論和意義：
　　本研究從體外體內(nèi)兩方面證明了NDR