鄰苯二甲酸二丁酯致雄性胎鼠尿道下裂的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分、鄰苯二甲酸二丁酯對胎鼠睪丸中類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白的影響及意義
　　目的：研究類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，StAR）的表達(dá)和活性以及睪酮在尿道下裂胎鼠體內(nèi)發(fā)生的改變，探討鄰苯二甲酸二丁酯（di-n-butyl phthalate，DBP）誘導(dǎo)雄性胎鼠發(fā)生尿道下裂的機(jī)制。
　　方法：
　?。?）40只孕SD大鼠，隨機(jī)分為DBP組和

2、對照組。孕第13-19天給予灌胃，DBP組按照800mg/kg體重DBP混合玉米油(DBP和玉米油總量為3ml/kg體重)灌胃，對照組按照3ml/kg體重玉米油灌胃。
　?。?）孕第19天取出胎鼠，觀察內(nèi)外生殖器鑒別出 DBP組中發(fā)生尿道下裂的雄性胎鼠及對照組中的雄性胎鼠并分為尿道下裂組和正常對照組，拍攝尿道下裂圖片，測量肛門生殖結(jié)節(jié)距離（anogenital distance，AGD），統(tǒng)計(jì)尿道下裂發(fā)生率，取各組胎鼠生殖結(jié)節(jié)用蘇

3、木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）進(jìn)行染色。
　?。?）各組胎鼠取血后檢測血清睪酮水平，取出各組胎鼠睪丸采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)、western blot、免疫熒光、酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測StARmRNA以及StAR蛋白的表達(dá)，用Pearson相關(guān)

4、性分析以明確StAR蛋白相對表達(dá)量和睪酮含量之間的關(guān)系。western blot檢測磷酸化ERK1/2蛋白（P-ERK1/2），總ERK1/2蛋白(T-ERK1/2)的表達(dá)，并通過兩者之間的比值分析睪丸中ERK1/2蛋白的磷酸化水平以明確StAR蛋白的活性高低。
　　結(jié)果：
　?。?）尿道下裂組胎鼠的尿道開口于生殖結(jié)節(jié)腹側(cè)，對照組的開口于生殖結(jié)節(jié)頂端。尿道下裂組的肛門生殖結(jié)節(jié)距離（1.77±0.12mm）明顯小于對照組（2.

5、25±0.15mm）（P<0.05）。胎鼠尿道下裂發(fā)生率為43.3％；
　　（2）尿道下裂組睪酮含量（1.45±0.62ng/ml）低于對照組（4.48±0.93ng/ml）（P<0.05）。尿道下裂組的 StARmRNA、StAR蛋白相對表達(dá)量以及P-ERK1/T-ERK1、P-ERK2/T-ERK2分別為2-△△Ct=0.23±0.08、0.33±0.07、0.17±0.03、0.19±0.07，對照組的分別為2-△△Ct=1

6、.00±0.00、1.44±0.19、0.31±0.08、0.43±0.14，兩組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。免疫熒光顯示睪丸間質(zhì)細(xì)胞中尿道下裂組StAR蛋白的表達(dá)少于對照組。尿道下裂組和對照組的Pearson相關(guān)系數(shù)分別為0.642（P<0.05）、0.851（P<0.05）。
　　結(jié)論：DBP不僅在轉(zhuǎn)錄和翻譯層面降低StAR的表達(dá)，可能還通過降低ERK1/2蛋白的磷酸化水平減弱StAR蛋白的活性使睪丸中睪酮合成障

7、礙，進(jìn)而影響了雄性胎鼠生殖器的發(fā)育。
　　第二部分、鄰苯二甲酸二丁酯對胎鼠生殖結(jié)節(jié)中成纖維細(xì)胞A/B同型雄激素受體的影響及意義
　　目的：研究尿道下裂胎鼠的生殖結(jié)節(jié)成纖維細(xì)胞中A/B同型雄激素受體（AR-A、AR-B）的表達(dá)，同時(shí)檢測成纖維細(xì)胞的增殖能力以及遷移能力，探討鄰苯二甲酸二丁酯致大鼠發(fā)生尿道下裂的機(jī)制。
　　方法：
　?。?）孕SD大鼠隨機(jī)分為DBP組和對照組。于懷孕第13-19天，DBP組按照800m

8、g/kg體重DBP溶入玉米油(DBP和玉米油總劑量為3ml/kg體重)后灌胃，對照組按照3ml/kg體重玉米油灌胃。
　?。?）懷孕19天取出胎鼠，鑒別出 DBP組中發(fā)生尿道下裂的雄性胎鼠及對照組中的雄性胎鼠并分為尿道下裂組和正常對照組。
　?。?）提取兩組胎鼠的生殖結(jié)節(jié)，用組織塊法原代培養(yǎng)成纖維細(xì)胞。
　?。?）Western blot檢測成纖維細(xì)胞AR-A、AR-B蛋白的表達(dá)，qPCR檢測ARmRNA表達(dá)。

9、　?。?）細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力變化，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力變化。
　　結(jié)果：
　?。?）尿道下裂結(jié)果詳見第一部分。
　?。?）所得細(xì)胞生長狀態(tài)良好，呈長梭型或多角型，細(xì)胞多有細(xì)長絲狀偽足。免疫熒光結(jié)果顯示兩組胎鼠生殖結(jié)節(jié)細(xì)胞的胞質(zhì)中均表達(dá)波形蛋白。
　?。?）AR-B蛋白在成纖維細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核中都有所表達(dá)，與對照組相比，尿道下裂組的AR-B蛋白相對表達(dá)量（胞質(zhì)：3.46±0.98 VS0.16±0.0

10、7；胞核：2.17±0.58 VS0.13±0.07，P<0.05）下降。AR-A蛋白只在胞核中有所表達(dá)，其相對表達(dá)量和ARmRNA相對表達(dá)量在兩組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　?。?）與對照組相比，尿道下裂組成纖維細(xì)胞增殖能力下降(96h:0.43±0.04 VS0.34±0.05；120h:0.50±0.04 VS0.41±0.04；144h:0.57±0.06 VS0.47±0.04，P<0.05)；平均遷移距離縮短（12h：0.1