鐵結(jié)合蛋白及其突變體的表達(dá)、純化、結(jié)構(gòu)和功能研究.pdf

1、鐵是生物體必需的微量元素，然而，在人類(lèi)和其他哺乳動(dòng)物中，由于在血液pH值條件下Fe3+會(huì)形成沉淀及產(chǎn)生氧化性損傷，血液中的Fe3+被嚴(yán)格調(diào)控在10-18mol·L-1。為維持生長(zhǎng)、繁殖，細(xì)菌進(jìn)化出高效的從宿主體內(nèi)獲取鐵的體系。鐵結(jié)合蛋白（ferric-ion binding protein，F(xiàn)BP）是這類(lèi)系統(tǒng)之一，是一些致病菌如奈瑟氏淋病雙球菌（Neisseria gonorrhoeae）、奈瑟氏腦膜炎雙球菌（Neisseria men

2、ingitidis）等細(xì)菌周質(zhì)中的一種高度保守的鐵運(yùn)載蛋白，與細(xì)菌的生長(zhǎng)，繁殖和致病能力密切相關(guān)。
　　 奈瑟氏菌屬的鐵結(jié)合蛋白為一水溶性單鏈蛋白質(zhì)，由309個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，分子量約34kDa，其晶體結(jié)構(gòu)顯示，多肽鏈構(gòu)成兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，用一個(gè)組氨酸（His9）、一個(gè)谷氨酸（Glu57）和2個(gè)酪氨酸（Tyr195與Tyr196）殘基與Fe3+配位，另有一個(gè)水分子和一個(gè)磷酸根離子作為配陰離子。鐵結(jié)合蛋白與Fe3+的結(jié)合為可逆性的，F(xiàn)e

3、3+能從含鐵鐵結(jié)合蛋白（holo-FBP）上脫去成為脫鐵鐵結(jié)合蛋白（apo-FBP）。一些其它金屬離子也可占據(jù)FBP中Fe3+的結(jié)合位點(diǎn)，因此其Fe3+的結(jié)合位點(diǎn)，可能是一些具有抗菌作用或抗癌活性的金屬離子的潛在靶點(diǎn)。
　　 蛋白質(zhì)磷酸化是最常見(jiàn)、最重要的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，它參與和調(diào)控生物體內(nèi)的許多生命活動(dòng)。通過(guò)蛋白激酶作用下的磷酸化和磷酸（酯）酶的作用下的去磷酸化，調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)、細(xì)胞周期等諸多細(xì)胞過(guò)程。已有文

4、獻(xiàn)報(bào)道，鐵結(jié)合蛋白除了具有運(yùn)載Fe3+的功能外，還有磷酸酯酶的活性，然而，其反應(yīng)機(jī)理未見(jiàn)報(bào)道，也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)apo-FBP的磷酸酯酶活性。
　　 本文首次報(bào)道了apo-FBP具有催化焦磷酸鍵（PPi）水解的酶學(xué)功能。利用31PNMR、V-Vis、Western blotting試驗(yàn)、ICP-AES等技術(shù)，測(cè)定了apo-FBP催化PPi水解的動(dòng)力學(xué)常數(shù)：在10mmol·L-1 pH7.4 Hepes緩沖液中，293K溫度下，該酶促反應(yīng)

5、為零級(jí)反應(yīng)。反應(yīng)速率與PPi的濃度無(wú)關(guān)但依賴(lài)于酶的濃度。當(dāng)[apo-FBP]為36、86、107、217μmol·L-1時(shí)，測(cè)得反應(yīng)速率常數(shù)分別為1.02×10-2、1.04×10-1、0.10、0.135mmol.L-1·h-1。反應(yīng)速率還與pH呈正相關(guān)，在相同條件下，[apo-FBP]為75μmol·L-1、[PPi]：[FBP]=50:1時(shí)，測(cè)得pH值為8.5時(shí)的反應(yīng)速率是pH值為7.4時(shí)的1.2倍，pH值為7.4時(shí)的反應(yīng)速率是p

6、H值為6.5時(shí)的1.18倍。而微量Fe3+對(duì)反應(yīng)有進(jìn)一步的催化作用，加入2％Fe3+，反應(yīng)速率增加到1.6倍。而holo-FBP催化PPi水解反應(yīng)的反應(yīng)速率是相同條件下apo-FBP的2.6倍。
　　 本文表達(dá)、純化了FBP突變體Y195F，發(fā)現(xiàn)其不含F(xiàn)e3+，且結(jié)合Fe3+的能力比原型FBP弱的多，形成三元復(fù)合物Y195F-Fe-（NTA）x的表觀結(jié)合常數(shù)為1.4×103L·mol-1（10mmol·L-1 pH7.4 Hep

7、es緩沖液，298K），而Y195F催化PPi水解的反應(yīng)速率僅是相同條件下apo-FBP的1/10（[Y195F]=79μmol·L-1，[PPi]：[Y195F]=50:1）。
　　 Western blotting試驗(yàn)、ICP-AES結(jié)果顯示，apo-FBP不含鐵和磷酸根，也沒(méi)有酪氨酸磷酸化現(xiàn)象，而holo-FBP、apo-FBP與PPi的反應(yīng)產(chǎn)物及holo-FBP與PPi的反應(yīng)產(chǎn)物都有酪氨酸磷酸化現(xiàn)象，每分子蛋白分別約含有

8、1個(gè)、2個(gè)和1個(gè)Pi。
　　 根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們提出了apo-FBP催化PPi水解的機(jī)理是通過(guò)蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化過(guò)程進(jìn)行的。而holo-FBP首先被PPi脫去Fe3+轉(zhuǎn)變?yōu)閍po-FBP，再通過(guò)酪氨酸磷酸化過(guò)程催化PPi的酶促水解反應(yīng)。磷酸化的位點(diǎn)就是Fe3+的結(jié)合位點(diǎn)Y195（Y196是否是磷酸化位點(diǎn)有待進(jìn)一步證實(shí)）。
　　 本文還制備了谷氨酸銅與apo-FBP的重組體，探索了培養(yǎng)晶體的條件，并用X-射線(xiàn)單晶衍射

9、對(duì)重組體的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步分析。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％～21％PEG4000，pH7.6～7.8，蛋白濃度為1～1.8mg/ml，溫度290K的條件下，可以得到大小合適，外觀規(guī)整的晶體，晶體的空間群為C222，每個(gè)晶胞含有9個(gè)蛋白分子，a=130.985A，b=162.650A，c=385.525A，α=β=γ=90°。
　　 本文研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌的鐵運(yùn)載蛋白FBP具有催化焦磷酸鍵水解，即磷酸酯酶的活性，而其作用的機(jī)理是通過(guò)鐵的關(guān)鍵