MircoRNA-27a靶向調(diào)控BMSCs分化預(yù)防激素性股骨頭壞死的實驗研究.pdf

1、背景與目的：
　　激素性股骨頭壞死（osteonecrosis of the femoral head, ONFH）有極高的致殘率，其預(yù)防和治療已經(jīng)成為世界性的難題。激素性 ONFH發(fā)生可能是由于激素的作用改變了細(xì)胞中的一些miRNA表達(dá)，影響了相應(yīng)靶向基因調(diào)控作用，從而使正常骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenhymal stem cells,BMSCs)的分化受到影響，造成了大量脂肪細(xì)胞的生成，和成骨細(xì)胞形成的

2、大量減少，影響了正常骨細(xì)胞的修復(fù)。因此促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和減少成脂細(xì)胞的分化是我們預(yù)防和治療激素性 ONFH最要的環(huán)節(jié)。以往的研究通過單一基因的改變來預(yù)防骨壞死，而本研究主要是利用miRNA具有多個靶向位點(diǎn)，篩選出具有抑制成脂肪分化同時具有促進(jìn)成骨分化的MicroRNA-27a基因，采用目前較成熟的RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)，通過將雙向調(diào)控基因 MicroRNA-27a電轉(zhuǎn)入大鼠BMSCs中，運(yùn)用細(xì)胞學(xué)

3、、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等多種的檢測手段和方法檢測該基因?qū)τ诔晒呛统芍挠绊?。在國?nèi)外的報道中，尚未有miRNA雙靶向基因調(diào)控預(yù)防激素性O(shè)NFH。
　　材料與方法：
　　選用2~3月齡的SD大鼠，體重約為180~200g，處死后取骨髓細(xì)胞，培養(yǎng)并制備大鼠BMSCs。將實驗分為4組，MicroRNA-27a組（miRNA1，M）：將具有雙向靶向作用的MicroRNA-27a電轉(zhuǎn)入大鼠BMSCs中并且加入激素誘導(dǎo)；陰性對照組（Ne

4、gativeControl，NC）：將無效序列的基因電轉(zhuǎn)入大鼠BMSCs中并在培養(yǎng)基中加入激素誘導(dǎo)；激素模型組（Model，M）：將 BMSCs單純的給予激素誘導(dǎo)；正常對照組（Normal，N）：無需特殊因素處理；對于激素誘導(dǎo)的各組細(xì)胞中保持地塞米松濃度為10-7mol/L，按時更換細(xì)胞液并定期觀察細(xì)胞的形態(tài)及。
　　在激素誘導(dǎo)第3天和第7天時，采用實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)技術(shù)分別測定各實驗組中的PPARγmR

5、NA、BMP mRNA的相對表達(dá)量。在激素誘導(dǎo)14天時，采取ELISA試劑盒測定各實驗組中的骨鈣素分泌量和甘油三脂的含量。在誘導(dǎo)14天時，對各組細(xì)胞進(jìn)行免疫組化，記錄并分析各組PPARγ、BMP蛋白表達(dá)水平。誘導(dǎo)21天時用油紅O方法對各組細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞染色，用倒置顯微鏡觀察并記錄脂肪細(xì)胞的數(shù)量。
　　結(jié)果：
　　1、各實驗組PPARγ mRNA和BMP mRNA表達(dá)檢測結(jié)果:
　　實驗第3天和第7天，測得陰性對照組和激素

6、模型組中的PPARγmRNA呈高表達(dá)，與正常對照組相比較，差異值有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。MicroRNA-27a組中的PPARγ mRNA呈低表達(dá)，與正常對照組無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。陰性對照組和激素模型組中的BMP mRNA呈低表達(dá)，與正常對照組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。MicroRNA-27a組中的BMP mRNA呈高表達(dá)，表達(dá)水平與正常對照組無統(tǒng)計學(xué)差異。（P>0.05）。
　　2、各實驗組BMSCs脂

7、肪染色和脂肪細(xì)胞計數(shù)結(jié)果：
　　實驗第21天，進(jìn)行油紅O染色并計數(shù)，與正常對照組相比較，激素模型組以及陰性對照組中脂滴數(shù)量升高增多，兩者的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。MicroRNA-27a組中脂滴量稍稍多于正常對照組，所檢測的差異值均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；且脂滴量明顯低于陰性對照組和激素模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　3、各實驗組骨鈣素含量和甘油三酯含量檢測結(jié)果：
　　實驗第14天，與

8、激素模型組和陰性對照組與與正常對照組相比較，骨鈣素含量降低，甘油三脂含量升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。MicroRNA-27a組檢測的骨鈣素含量稍低于正常對照組，甘油三脂含量稍高于正常對照組，差異值均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
　　4、各實驗組免疫組化測定PPARγ以及BMP-2蛋白表達(dá)MIOD結(jié)果：
　　實驗14天，通過免疫組化測得陰性對照組和激素模型組中的PPARγ表達(dá)量高，與正常對照組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義

9、（P<0.05）。MicroRNA-27a組中的PPARγ表達(dá)量低，與正常對照組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。陰性對照組和激素模型組中的 BMP表達(dá)低，與正常對照組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（ P<0.05）。MicroRNA-27a中的 BMP表達(dá)量高，表達(dá)水平與正常對照組無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.MicroRNA-27a能抑制成脂基因的表達(dá)，促進(jìn)成骨基因的表達(dá)。
　　2.依據(jù)MicroRN