赤點石斑魚、大黃魚幾種天然免疫因子的基因克隆及特性研究.pdf

1、脊椎動物中免疫系統(tǒng)主要由天然免疫與適應(yīng)性免疫兩部分組成。魚類作為最低等的脊椎動物，雖然在進(jìn)化中獲得了適應(yīng)性免疫，由于魚類的適應(yīng)性免疫的產(chǎn)生受到多種因素的影響。在抵抗外界病原入侵的過程中，魚類的天然免疫系統(tǒng)仍然具有至關(guān)重要的作用。本研究以赤點石斑魚與大黃魚為研究對象，對赤點石斑魚的天然免疫因子凝集素、MHCIIB與ICLP，大黃魚的識別因子肽聚糖識別蛋白(peptidoglycan recognition protein，PGRP)與巨噬

2、細(xì)胞移動抑制因子(Macrophage Migration Inhibitory Factor，MIF)進(jìn)行了初步研究。報告內(nèi)容如下： 1.凝集素(lectin)在脊椎動物與無脊椎動物中是天然免疫系統(tǒng)關(guān)鍵的組成部分，能夠特異識別清除病原菌。本研究基于赤點石斑魚的EST序列設(shè)計特異引物，通過RACE的方法得到該基因全長cDNA序列，將其命名為EALecl。其中cDNA序列全長為827bp，5-UTR為28bp，3-UTR為151

3、bp，具有明顯的加尾信號AATAAA。開放閱讀框648bp，編碼215個氨基酸，其中信號肽長度為31個氨基酸。氨基酸分析表明，該序列在N端有豐富的半胱氨酸殘基、膠原區(qū)特點的G-X-Y重復(fù)序列、頸區(qū)及C-末端具有糖識別位點，屬于C型膠原凝集素；其CRD區(qū)域的糖識別關(guān)鍵氨基酸為EPD，可能是甘露糖型凝集素向半乳糖型凝集素分化的一個過度類型。 2.RT-PCR以及real-timePCR檢測結(jié)果表明在赤點石斑魚的12個不同組織中均有

4、不同程度的表達(dá)。RT-PCRSSCP結(jié)果表明在赤點石斑魚的12個組織中，獲得4種表達(dá)類型的Lectin，利用PCR獲得了lectinDNA序列，與cDNA相比較，EALec具有4個內(nèi)含子，5個外顯子。將EALec-1克隆到pET28(A)轉(zhuǎn)化BL21表達(dá)菌中，獲得26Kd大小的蛋白表達(dá)片段，體外試驗表明，該蛋白對革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌均具有凝集作用，糖特異性結(jié)合試驗表明，該蛋白為甘露糖型凝集素。 3.本研究克隆獲得赤點石斑

5、魚非特異性免疫因子MHCIIB基因的4個cDNA全序列，序列全長為1195-1355bp，含有3’UTR、啟動子、多肽結(jié)合區(qū)(β1)、IGC區(qū)(β2)、跨膜區(qū)、胞質(zhì)區(qū)和5‘UTR區(qū)，編碼區(qū)大小為750bp。RT-PCR與SSCP技術(shù)研究了赤點石斑魚MHCIIB的表達(dá)多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)其在頭腎、心、肝等12個組織器官中均能有效表達(dá)，表達(dá)多態(tài)性也異常豐富。 4.MHCclassII恒定鏈(invariantchain-likeprote

6、insICLP)與免疫反應(yīng)密切相關(guān)，其參與對抗原的處理，保證多肽不被進(jìn)一步降解為氨基酸。通過RACE反應(yīng)獲得赤點石斑魚ICLP2cDNA全序列，全長1837bp，包括44bp的5’UTR區(qū)，861bp的開放閱讀框以及932bp的3’UTR區(qū)，編碼286個氨基酸。對赤點石斑魚10個組織的ICLP2基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序，結(jié)果表明赤點石斑魚ICLP2基因的表達(dá)不存在組織特異性。此外，氨基酸序列同源比對的結(jié)果表明，赤點石斑魚與其它16種脊椎

7、動物ICLP2的相似度在25～78％之間，與狼鱸和鱖魚ICLP2因子的同源程度最高，分別為78％和74％。 5.肽聚糖識別蛋白II(pglyrp2)是一類具酰胺酶的模式識別受體，通過RACE技術(shù)克隆了大黃魚的pglyrp2基因，cDNA全長1831bp，帶有一個1449bp的開放閱讀框，編碼帶有一個21個氨基酸信號肽的482個氨基酸的pglyrp2蛋白。RT-PCR和熒光定量PCR分析表明，大黃魚pglyrp2基因在肝臟強(qiáng)烈表

8、達(dá)，在性腺、腸、胃中弱表達(dá)；大黃魚的pglyrp2還在未受精卵中高度表達(dá)，在胚胎發(fā)育和卵黃囊仔魚階段低量表達(dá)。通過人工感染模型發(fā)現(xiàn)，大黃魚的pglyrp2還是一種組成型兼誘導(dǎo)型的急性時相蛋白，它的誘導(dǎo)伴隨著宿主抗氧化免疫防御反應(yīng)的激活。通過原核表達(dá)載體PET28a表達(dá)并純化了大黃魚pglyrp2的重組蛋白。 6.本文采用同源克隆的方法從大黃魚肝臟中克隆了大黃魚MIF的同源基因。大黃魚MIF的cDNA全長634bp，編碼一個長1

9、15aa的蛋白質(zhì)，其基因結(jié)構(gòu)非常保守，具有3個外顯子和2個內(nèi)含子。RT-PCR與熒光定量PCR研究表明：大黃魚MIF基因在所選的11個組織中都有表達(dá)，其中在腦和肝中表達(dá)量較高。將哈維氏弧菌(Vibroharveyi)人工攻毒后的大黃魚作為研究炎癥反應(yīng)的材料，發(fā)現(xiàn)大黃魚MIF在攻毒后大黃魚的肝臟、性腺和頭腎中的mRNA表達(dá)量顯著升高。首次表明魚類MIF可能參與了炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。利用原核表達(dá)載體PET28a，體外表達(dá)和純化了大黃魚MIF