Streptomyces hygroscopicus谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原基因的鑒定、表達(dá)及序列分析.pdf

1、微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(MicrobialTransglutaminase，簡稱MTG，EC2.3.2.13)能催化多種蛋白質(zhì)分子間、分子內(nèi)的?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，改善各種蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，在食品、化妝品、制藥等工業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。 為鑒定來源于吸水鏈霉菌的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶基因；研究其在大腸桿菌系統(tǒng)的表達(dá)；分析該酶與其同源酶的活性中心氨基酸序列及其三維結(jié)構(gòu)，本論文主要研究內(nèi)容如下： 1.提取吸水鏈霉菌(Streptomyce

2、shygroscopicus；CCTCCM203062)的總DNA，利用純化得到的天然谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶原(pro—MTGase)，測定N—端前十個(gè)氨基酸序列，以及根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫不同微生物來源的MTGase基因保守序列設(shè)計(jì)引物，完整的克隆得到Streptomyceshygroscopicus來源的pro—MTGase基因序列。本研究是對(duì)吸水鏈霉菌來源的TGase基因的首次報(bào)道。 2.對(duì)目的基因進(jìn)行測序，確定吸水鏈霉菌pro—M

3、TGase基因共1170bp，編碼389個(gè)氨基酸，其堿基序列與其它鏈霉菌來源的同源性較高，與Streptomycescaniferus，Streptomycesplatensis，Streptomycespaucisporogenes等同源性高達(dá)92％。氨基酸序列1—58位為pro—region；59-389位共331個(gè)氨基酸為成熟酶編碼區(qū)；第122位氨基酸Cys為活性中心位點(diǎn)，成熟酶分子中催化三聯(lián)體為‘Cys64—His274—Asp

4、255,與其它鏈霉菌來源的同源酶一致。 3.利用pET-20b(+)載體系統(tǒng)構(gòu)建了多種表達(dá)載體，通過宿主菌BL21(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)始終形成包涵體，而利用宿主菌Rosetta(DE3)pLysS獲得了少量的胞外可溶性表達(dá)。通過培養(yǎng)及誘導(dǎo)條件的研究，確定37℃培養(yǎng)至OD600=1.5，添加IPTG終濃度0.4mmol/L，降溫到24℃誘導(dǎo)24h，得到發(fā)酵上清液最高酶活0.35U/mL。SDS-PAGE顯示，胞外表達(dá)重組蛋白的分

5、子量約為44kDa，與吸水鏈霉菌表達(dá)的天然酶原大小相符。這也是在國內(nèi)首次利用大腸桿菌系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了MTGase的可溶性胞外表達(dá)。 4.對(duì)吸水鏈霉菌的MTGase基因利用生物信息學(xué)手段進(jìn)行序列分析、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測及三維結(jié)構(gòu)建模，發(fā)現(xiàn)其二級(jí)結(jié)構(gòu)由許多α螺旋、轉(zhuǎn)角和少量β折疊構(gòu)成；活性中心位點(diǎn)氨基酸殘基Cys在轉(zhuǎn)角的一個(gè)疏水區(qū)內(nèi)，以便保持穩(wěn)定；對(duì)催化三聯(lián)體的催化機(jī)理進(jìn)行初步研究；同源建模預(yù)測的三維結(jié)構(gòu)基本能真實(shí)的反映MTGase空間構(gòu)象，為