發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)八寶景天遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立.pdf

1、經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌(rhizogenes)轉(zhuǎn)化的植株不僅表現(xiàn)出生根能力明顯提高,而且通常還表現(xiàn)出葉片和花的形態(tài)、色素形成、節(jié)間長短、生活周期及向地性等性狀的可遺傳的變異,其中許多變異如植株矮化、節(jié)間縮短、花形和葉形改變等在園林植物品種改良中有很大的應(yīng)用價值。本文擬通過發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化八寶景天(Sedum Spectabile Boreau)來獲得轉(zhuǎn)基因植株并且篩選優(yōu)良新品種。采用八寶景天嫩莖作為外植體進行組織培養(yǎng),在附加不同濃度激素的培養(yǎng)基上對

2、其進行增殖、生根培養(yǎng),誘導(dǎo)葉片愈傷組織的發(fā)生及葉片愈傷組織不定芽的分化,建立其葉片再生體系。在建立八寶景天葉片再生體系的基礎(chǔ)上,研究影響八寶景天遺傳轉(zhuǎn)化的若干因素,通過遺傳轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,建立了發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化體系,獲得了轉(zhuǎn)基因植株。對轉(zhuǎn)化再生植株進行了形態(tài)鑒定、PCR檢測,并對轉(zhuǎn)化植株形態(tài)及生長變異進行了初步研究,主要研究結(jié)果如下：
　　 1.葉片外殖體高效再生系統(tǒng)的建立：篩選出適宜八寶景天分化培養(yǎng)基是不附

3、加任何激素的MS培養(yǎng)基,適宜生根培養(yǎng)基是不附加任何激素的1/2MS培養(yǎng)基，適宜誘導(dǎo)葉片愈傷組織發(fā)生的培養(yǎng)基是MS+6-BA 0.3mg.L-1+NAA 0.1mg.L-1，適宜誘導(dǎo)葉片愈傷組織不定芽分化的培養(yǎng)基是MS+6-BA 0.3mg.L-1+NAA 0.1mg.L-1。研究了暗培養(yǎng)對誘導(dǎo)葉片不定芽的影響,結(jié)果表明,暗培養(yǎng)5d有利于不定芽的誘導(dǎo)。
　　 2.頭孢噻肟鈉(CTX)對誘導(dǎo)八寶景天葉片不定芽的影響和對農(nóng)桿菌的抑菌效

4、果：確定適宜的CTX濃度為400 mg.L-1。
　　 3.影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的幾個主要因素：發(fā)根農(nóng)桿菌活化次數(shù)、菌液濃度、侵染時間、共培養(yǎng)時間等對轉(zhuǎn)化頻率都有一定影響,在轉(zhuǎn)化過程中菌株活化3次以上,菌液濃度OD600=0.4,侵染時間10min，共培養(yǎng)2 d,有利于獲得最高遺傳轉(zhuǎn)化效率。
　　 4.轉(zhuǎn)基因植株的獲得：利用介導(dǎo)法將發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入八寶景天葉片中,獲得了轉(zhuǎn)基因植株,對轉(zhuǎn)基因植株進行了PCR檢測,證明發(fā)根農(nóng)桿菌