播娘蒿DREB1-CBF基因的克隆和表達(dá)及其轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的篩選.pdf

1、四川I大學(xué)碩士學(xué)位論文題目揸蝗莖纓絲迦基固煎盤隆查盤墊叢甚掛基因墊壹薟墊掛鮑籃墊作者垡塑蘭完成日期星QQZ生壘旦蘭Q旦指導(dǎo)教師疊垡鏊整撞專業(yè)絲生塑堂研究方向絲生塑僉王生塹堂授予學(xué)位日期生旦旦行研究，為進(jìn)一步從分子水平上解釋耐寒植物與不耐寒植物之間的不同，填補(bǔ)了耐寒植物的抗寒機(jī)制研究的空白打下了基礎(chǔ)，對(duì)進(jìn)一步探索植物的抗逆機(jī)制和培育優(yōu)良的抗寒經(jīng)濟(jì)作物有重要的意義，開展研究得到以下成果：一、克隆DsCBFl基因cDNA全長(zhǎng)及DsCBF2基因

2、EST。通過CLONTECH的5’RACE的方法得到播娘蒿DsCBFl基因的cDNA全長(zhǎng)序列946bp；并結(jié)合其他物種的CBF基因序列進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)其同源保守區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，利用同源克隆得到播娘蒿第二條CBF基因640bp大小的EST序列暫時(shí)命名為DsCBF2。二、生物信息學(xué)分析證明所得的DsCBF基因序列屬于CBF基因家族。通過分析，得到正確完整的CBFl基因ORF框642bp，對(duì)兩條播娘蒿的CBF基因進(jìn)行核酸序列比對(duì)，它們之間具有非

3、常高的同源性，而且其N端的同源性明顯高于C端，推測(cè)它們?cè)诜肿舆M(jìn)化中可能是由一條基因產(chǎn)生。將DsCBFl基因所推演出的蛋白質(zhì)序列和已知物種的DREBl／CBF蛋白比較，發(fā)現(xiàn)它具有DREBl／CBF轉(zhuǎn)錄因子的典型特征。通過構(gòu)建多個(gè)物種進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，DsCBFl與AtcBF3親緣關(guān)系更近，推測(cè)其功能與表達(dá)機(jī)制和AtCBFI～3相似。三、研究DsCBF基因在冷脅迫下的mRNA轉(zhuǎn)錄水平差異，證明它們的確受冷脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。采用熒光定量PCR的方法，對(duì)

4、播娘蒿的兩條CBF基因進(jìn)行冷脅迫下的差異表達(dá)研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在持續(xù)的冷脅迫下，DsCBFl和DsCBF2都被快速誘導(dǎo)，二者的mRNA水平有明顯差異，且在轉(zhuǎn)錄上存在時(shí)間和空間的差異，這可能預(yù)示了二者在抗寒機(jī)制中的優(yōu)秀協(xié)同作用。在常溫下，DsCBFl和DsCBF2基本上沒有表達(dá)，而且DsCBFl在在溫度下降至10℃時(shí)，轉(zhuǎn)錄水平才有較大的增長(zhǎng)。隨溫度的越低，檢測(cè)到DsCBF的mRNA水平越高；在低溫處理2h后回復(fù)22℃處理30min，其m

5、RNA水平明顯快速下降，這顯示出CBF基因在植物對(duì)抗冷脅迫的途徑中的快速的調(diào)控機(jī)制。該研究?jī)?nèi)容為今后開展播娘蒿DsCBF基因家族的功能研究奠定了基礎(chǔ)。四、建立花序轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)基因體系，獲得DsCBFI轉(zhuǎn)基因擬南芥功能驗(yàn)證體系。根據(jù)播娘蒿的DsCBFl基因的ORF序列設(shè)計(jì)引物，克隆得到該基因的ORF全長(zhǎng)，構(gòu)建到植物雙元表達(dá)載體中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法，將其轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中，為今后的進(jìn)一步篩選以及研究DsCBFl的體內(nèi)功能奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵