蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白Cry1Ba和Vip3Aa的結(jié)構(gòu)和功能研究.pdf

1、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)是目前世界上應(yīng)用范圍最廣的殺蟲微生物，其殺蟲活性主要源于其在生長過程中產(chǎn)生的多種具有殺蟲活性的蛋白質(zhì)，包括殺蟲晶體蛋白、營養(yǎng)期殺蟲蛋白、輔助蛋白等。目前，關(guān)于殺蟲蛋白的結(jié)構(gòu)以及結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的研究是國內(nèi)外一個熱點。本研究以Cry1Ba和Vip3Aa蛋白為對象，對兩種蛋白的晶體學(xué)、以及結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系進行了研究，取得了以下研究結(jié)果： 通過三維結(jié)構(gòu)模擬以及同源序列

2、分析，找到了Cry1Ba蛋白的三個結(jié)構(gòu)域、以及結(jié)構(gòu)域Ⅱ中三個Loop所對應(yīng)的氨基酸序列。為了明確各Loop的功能，以及Loop突變對Cry1Ba蛋白殺蟲活性的影響，通過重疊引物PCR將Cry1Ba蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅱ中的三個Loop分別進行了突變，共獲得了5個突變體M1(Loop1：340WSNTR344-缺失(Cry1A))、M2(Loop2:402Y-G)、M3(Loop2：400GIYLEP405-PSAV(Cry3A))、M4(Loop

3、2:400GIYLEPIH407-ILGS(Cry1A))、M5(Loop3:472LQSRV476-AGAVYTL(Cry1A))。將這些突變體分別對小菜蛾(Plutellaxylostella)進行了殺蟲活性測定。結(jié)果表明，與Cry1Ba(LC500.961μg/ml)相比，Loop1的缺失突變M1毒力顯著降低，LC50為35.51μg/ml；在Loop2的突變中，單個氨基酸的突變M2毒力略有下降(LC50為1.31μg/ml)；而

4、另兩種突變(M3和M4)對小菜蛾的毒力則明顯降低，LC50值分別為11.56μg/ml、34.8μg/ml；Loop3的突變M5對小菜蛾的毒力略有提高(LC500.81μg/ml)，但與Cry1Ba差異不顯著。對Cry1Ba蛋白突變前后結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的分析結(jié)果表明，Loop改變對Cry1Ba蛋白的結(jié)構(gòu)和功能影響非常顯著；Loop1和Loop2在決定Cry1Ba對小菜蛾的毒性方面起著重要作用；Loop的長度也是決定其殺蟲特異性的一個決

5、定因素。 此外，為了進一步揭示DomainⅢ的功能，以及結(jié)構(gòu)域互換對Cry1Ba和Cry3Aa蛋白殺蟲活性的影響，通過重疊引物PCR將編碼Cry1Ba和Cry3Aa蛋白DomainⅢ的DNA片段互換，得到兩個1.9kb的雜合蛋白基因cry1B1B3Aa和crv3A3A1Ba，并分別導(dǎo)入大腸桿菌中進行表達。SDS-PAGE分析結(jié)果表明兩種雜合蛋白的大小都為70kDa左右。生測結(jié)果顯示，兩種雜合蛋白對榆蘭葉甲(Pvrrhaltaae

6、neseens)都沒有殺蟲活性；對小菜蛾(P.xylostella)的殺蟲活性，與Cry1Ba蛋白相比，都有不同程度的下降。這些結(jié)果表明，DomainⅢ的改變對殺蟲晶體蛋白的活性具有很大的影響；在Cry1Ba中，它對于蛋白的殺蟲特異性并不是起決定性作用。 營養(yǎng)期殺蟲蛋白是一類新型的殺蟲蛋白。為了揭示營養(yǎng)期殺蟲蛋白Vip3Aa的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，首先通過蛋白分析軟件對Vip3Aa蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行了預(yù)測，并從中找到一個糖結(jié)合結(jié)

7、構(gòu)域。依據(jù)預(yù)測結(jié)果，將Vip3A分成為6個不同的蛋白片段，分別在大腸桿菌中分別進行了表達、純化。將含有糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白片段與棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)和甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)的中腸BBMV分別進行了結(jié)合分析。結(jié)果表明，含有糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白片段Vip3Aa521-687可以與棉鈴蟲和甜菜夜蛾的BBMV相結(jié)合，但結(jié)合作用很弱。上述結(jié)果表明，此蛋白片段可能參與了Vip3Aa蛋白與受體的結(jié)合，

8、但需要進一步深入研究。 通過親和層析的方法純化了對小菜蛾高毒力的Cry1Ba活性區(qū)蛋白片斷以及對甜菜夜蛾高毒力的營養(yǎng)期殺蟲蛋白Vip3Aa。經(jīng)胰蛋白酶消化后，通過高效液相色譜(分析篩和陰離子交換)純化了具有殺蟲活性的60kDa毒蛋白核心片段。然后采用氣相擴散法，探索了兩種蛋白體外結(jié)晶的條件，分別得到了兩種蛋白的晶體。初步的X-ray衍射分析結(jié)果表明，Cry1Ba蛋白可以在較低的分辨率下產(chǎn)生衍射。這些結(jié)果為進一步揭示這兩種蛋白的結(jié)