重組大腸桿菌DNA聚合酶的提取及純化研究.pdf

1、PCR是分子生物學(xué)中最重要的工具之一。在PCR技術(shù)中，DNA聚合酶起著關(guān)鍵生作用。TaqDNA酶是從嗜熱桿菌中分離純化得到的第一個(gè)用于PCR的熱穩(wěn)定性DNA聚合酶。PfuDNA酶具有3’-5’外切酶活性，是保真度最高的DNA聚合酶之一。本文主要研究從重組工程菌中分別提取PfuDNA聚合酶及TaqDNA聚合酶。 以重組表達(dá)質(zhì)粒p-Taq轉(zhuǎn)化宿主菌E.coliDH5á，獲得轉(zhuǎn)化子。利用Taq酶的熱穩(wěn)定性，將破胞液在75℃水浴1h，

2、然后用硫酸銨沉淀法獲得純化的表達(dá)蛋白。對(duì)重組E.coli的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化培養(yǎng)條件為：在OD600=0.8時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)，IPTG的終濃度為125mg/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間為9h，誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度為37℃。在優(yōu)化條件下，1L發(fā)酵液可得50,000單位的聚合酶，比活可達(dá)10,000U/mg蛋白質(zhì)。 用PfuDNA聚合酶的表達(dá)質(zhì)粒pET-Pfu(表達(dá)載體為pET11)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)(含有pLysS質(zhì)粒)得到重組工

3、程菌。在Pfu酶的純化過程中，用溶菌酶裂解細(xì)胞，利用Pfu酶的熱穩(wěn)定性，采用熱變性法(凍融法)除去絕大部分雜質(zhì)蛋白，得到Pfu酶粗溶液。然后嘗試使用磷酸纖維素P11、CM-SepharoseCL-6B、DEAE-SepharoseFF、JK110等幾種離子交換樹脂，及葡聚糖凝膠G-200、SephacrylS-200、SephadexG-100、SephadexG-75等幾種凝膠樹脂，來進(jìn)一步純化Pfu酶。研究用無毒價(jià)廉的乳糖代替IPT

4、G作誘導(dǎo)劑，并對(duì)誘導(dǎo)條件進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化條件為：培養(yǎng)液接種后立即加入1g/L的乳糖，誘導(dǎo)培養(yǎng)8h后收獲菌體。用優(yōu)化后的培養(yǎng)條件及純化技術(shù)，在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中制備重組PfuDNA聚合酶。將破胞液在75℃水浴20min，然后依次過JK110離子交換柱和SephadexG-75凝膠柱得到純化Pfu酶。在PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中，純化產(chǎn)品具有與商品酶類似的活性和擴(kuò)增效果，從500ml培養(yǎng)液中共得到3×105U的聚合酶，純化Pfu酶比活達(dá)到22,200U/m