胚胎早期發(fā)育過程中CTB和EVT的基因表達(dá)譜研究.pdf

1、目的：本實驗運(yùn)用不同濃度胰酶消化法分別消化正常妊娠8～12周的人工流產(chǎn)絨毛和蛻膜組織，分離得到純度較高的細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞(CTB)和絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞(EVT)；利用高通量的基因芯片技術(shù)制備CTB和EVT基因表達(dá)譜芯片，對比分析獲取差異表達(dá)基因。同時，對CTB的標(biāo)志物HAI-1基因及其表達(dá)產(chǎn)物在絨毛組織中的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行了初步研究。為探討胚胎早期發(fā)育過程中滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制提供了實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。 方法：l、收集正常妊

2、娠第8～12周絨毛和蛻膜組織，胰酶消化法分離CTB和EVT，分析細(xì)胞純度和活性。 2、提取CTB和EVT的總RNA，檢測RNA純度和完整性。 3、RNA送公司制備基因芯片，并提取基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)。 4、分析數(shù)據(jù)，獲取差異表達(dá)基因。 5、選取兩個差異表達(dá)基因MMP-9和TIMP-1，RT-PCR驗證芯片結(jié)果可靠性。 6、分析差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能，并對基因進(jìn)行分類檢索。 7、RT-PCR和免

3、疫組織化學(xué)法檢測CTB標(biāo)志物HAI-1基因和蛋白 在絨毛組織中的動態(tài)表達(dá)。 結(jié)果：1、運(yùn)用不同濃度胰酶消化法消化絨毛和蛻膜組織，獲得純度較高的CTB和EVT。 2、RNA純度及完整性分析，A260／280達(dá)到1．9～2．1，28SrRNA和18SrRNA電泳條帶清晰，亮度之比約為2：l，表明所抽提的RNA達(dá)到實驗要求。 3、建立了CTB和EVT的基因表達(dá)譜芯片，質(zhì)控合格。RT-PCR驗證MMP-9和TIM

4、P-1表達(dá)與芯片結(jié)果一致，證實芯片結(jié)果可信。 4、芯片檢測CTB和EVT基因表達(dá)譜，在全基因組54675個基因(或EST)中，共篩選到1318個差異表達(dá)基因(或EST)，占約2．4％：聚類分析結(jié)果顯示上調(diào)基因813個，下調(diào)基因505個。所有差異表達(dá)基因按GeneOntoloty功能分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了功能檢索分類。 5、綜合分析不同生物學(xué)功能類別的1318個差異表達(dá)基因(或EST)，共檢索到細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因上調(diào)29個、下調(diào)1

5、1個；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因上調(diào)87個、下調(diào)53個；轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān)基因上調(diào)80個、下調(diào)40個；細(xì)胞生長／維持相關(guān)基因上調(diào)41個、下調(diào)15個；代謝相關(guān)基因上調(diào)95個、下調(diào)36個；凋亡相關(guān)基因上調(diào)17個、下調(diào)11個；物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因上調(diào)104個、下調(diào)47個；細(xì)胞周期相關(guān)基因上調(diào)16個、下調(diào)7個；應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因上調(diào)6個、下調(diào)0個；細(xì)胞防御反應(yīng)相關(guān)基因上調(diào)4個、下調(diào)5個；免疫應(yīng)答相關(guān)基因上調(diào)69個、下調(diào)5個；細(xì)胞黏附相關(guān)基因上調(diào)46個、下調(diào)28個；發(fā)

6、育相關(guān)基因上調(diào)58個、下調(diào)21個。此外，通過檢索，我們發(fā)現(xiàn)有327個基因尚無功能描述，其中上調(diào)195個、下調(diào)132個。 6、RT-PCR測得HAI-1基因在絨毛組織中有表達(dá)，且其表達(dá)量隨妊娠周數(shù)增加而逐漸上調(diào)，在妊娠第6周HAI-1基因表達(dá)量極低，隨后表達(dá)量逐漸升高，至第9周達(dá)高峰，且高峰持續(xù)至第10周。免疫組織化學(xué)法顯示HAl-1蛋白表達(dá)隨妊娠周數(shù)增加呈遞增趨勢，與RT-PCR結(jié)果吻合。 結(jié)論：1、采用不同濃度胰酶消化

7、、紅細(xì)胞裂解和Percoll梯度離心等方法成功分離CTB和EVT，這是對傳統(tǒng)方法的改進(jìn)，既方便實用，又可以節(jié)約實驗經(jīng)費(fèi)。 2、建立了CTB和EVT的全基因組表達(dá)譜芯片，并獲取差異表達(dá)基因，其中某些基因是目前尚未報道生物學(xué)功能或在胚胎發(fā)育方面無相關(guān)報道的新基因，同時，實驗還印證了當(dāng)前已經(jīng)報道和胚胎發(fā)育相關(guān)的基因。 3、通過綜合分析不同生物學(xué)功能類別的差異表達(dá)基因的表達(dá)變化，提示滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲可能存在以下一些調(diào)節(jié)機(jī)制：細(xì)胞黏

8、附和細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)活躍，如MMP-1、MMP-2、MMP-9，ICAM-1等基因上調(diào)明顯，表明這些基因參與了EVT識別、黏附、并降解細(xì)胞外基質(zhì)，侵入血管內(nèi)皮使母體血管重建，從而開啟胎盤的血流供應(yīng)這一過程；免疫應(yīng)答和細(xì)胞防御反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，參與母體對胎兒的免疫“容受性”調(diào)節(jié)，使胎兒免受母體的免疫排斥；眾多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因發(fā)生改變，總體趨勢是使細(xì)胞向增殖期轉(zhuǎn)變，發(fā)生增殖和分化，有序地形成功能不同的組織和系統(tǒng)，