甘草內(nèi)生真菌的分離鑒定及其次級代謝產(chǎn)物生物活性的研究.pdf

1、近年研究表明，植物內(nèi)生真菌種屬眾多，數(shù)量龐大，從其次生代謝產(chǎn)物中已分離出許多結(jié)構(gòu)新穎的活性物質(zhì)，具有良好的藥理活性。本文選用甘草為研究材料，對甘草內(nèi)生真菌及其代謝產(chǎn)物進行活性研究。內(nèi)容主要包括：甘草內(nèi)生真菌的分離鑒定；抑菌活性的研究；抗氧化活性的研究；抑制α-葡萄糖苷酶活性的研究；化學(xué)成分的分離和活性的研究。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴利用組織切塊法從生長狀況良好的新鮮甘草中分離得到36株內(nèi)生真菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定及分子生物學(xué)鑒定,3

2、6株內(nèi)生真菌分別為青霉屬（Penicillium sp.）4株、根霉屬（Rhizopus sp.）8株、木霉屬（Trichoderma sp.）11株、鐮孢霉屬（Fusarium sp.）5株、曲霉屬（Moniliales sp.）7株和小鼻枝霉屬（Rhinocladiella sp）1株。⑵內(nèi)生真菌發(fā)酵液利用正丁醇和乙酸乙酯萃?。痪z體利用乙醇回流提取，共得108個樣品。對樣品進行抑菌實驗結(jié)果顯示，47個樣品對6種指示菌有不同程度的抑

3、制作用，占全部樣品的43.52％，其中4個樣品對6種指示菌全部具有較強的抑制作用，對4個樣品進行最小抑菌濃度實驗結(jié)果顯示其對指示菌的最小抑制濃度為0.25mg/mL。⑶所有樣品在濃度為0.05mg/mL時均表現(xiàn)出了一定的還原能力，G-207正丁醇萃取物和G-601菌絲體提取物的還原力分別達到2.607和2.656，略低于陽性對照Vc的還原力2.693。⑷樣品在0.25mg/mL時對·OH清除率較強，有11個樣品對·OH的清除率在75%以

4、上，占樣品總數(shù)的10.12%。其中G-504的菌體部為和G-603的正丁醇部萃取物對·OH的清除率分別達到93.65%和94.76%，都高于陽性對照 Vc清除率的92.86%，顯示出極強的清除活性。⑸當(dāng)樣品濃度在0.025mg/mL時，108個樣品中，101個樣品都顯示出對DPPH·不同程度的清除作用，53個樣品對DPPH·的清除率在50%以上，占總體的49.07%，其中G-102、G-105、G-202、G-504的正丁醇部位；G-2

5、07、G-402、G-601的菌絲體部位；G-203、G-304的乙酸乙酯部位對DPPH·的清除率在75%以上，G-601菌絲體部位的清除率是96.07%，高于陽性對照Vc的95.75%。⑹當(dāng)樣品濃度在1mg/mL時，絕大多數(shù)粗提物對α-葡萄糖苷酶的活性具有一定的抑制作用。其中G-203、G-207和G-602的乙酸乙酯粗提物，G-208、G-302的正丁醇粗提物，G-304的菌絲粗提物對α-葡萄糖苷酶的抑制率均在45%以上，抑制率最高

6、的G-203的乙酸乙酯粗提物抑制α-葡萄糖苷酶的IC50是0.878mg/mL，大于陽性對照阿卡波糖的0.817 mg/mL。⑺利用硅膠柱層析、薄層層析、制備薄層色譜等分離方法，從內(nèi)生真菌 G-207和G-504發(fā)酵液的乙酸乙酯、正丁醇萃取物和菌絲粗提物中分離得到6種化合物，經(jīng)1H-NMR、13C-NMR以及HSQC等技術(shù)對化合物鑒定結(jié)果為：5-羥基-7，3‘，4‘-三甲氧基黃酮（1）、ent-考蘭烷-16，17-二醇（2）、1-亞油酸

7、-3-棕櫚酸-甘油酯（3）、鄰苯二甲酸二丁酯（4）、豆甾醇（5）和3，4，5-三甲氧基苯基丙酮（6）。⑻對分離得到的6種化合物進行抑菌試驗，結(jié)果顯示：化合物3、5、6具有較好的抑菌活性。其中化合物3對指示菌的抑制作用最為明顯，其對肺炎克雷伯菌、大腸桿菌和乳鏈球菌的最小抑菌濃度為0.25mg/mL。⑼樣品濃度在0.025 mg/mL時，所有樣品都具有不同程度的還原能力，化合物1、6的吸光度值分別為2.074和2.113，略低于陽性對照Vc

8、的吸光值2.187，具有較強的還原力。⑽以水楊酸作為Fenton試劑反應(yīng)產(chǎn)生的·OH的捕捉劑來測定樣品對·OH的清除能力，當(dāng)樣品濃度為0.1 mg/mL時，所有樣品都具有一定的·OH清除率，化合物1、3、6的清除率在50%以上。⑾樣品濃度為0.025mg/mL時，樣品對 DPPH·具有一定的清除效果，化合物1、2、3、6對 DPPH·的清除率達到70%以上?；衔?、6的 IC50值分別是0.0384、0.0367（mg/mL），高于陽