轉(zhuǎn)抗旱相關(guān)基因煙草的獲得及其抗旱性分析.pdf

1、作物產(chǎn)量受到多種因素的影響，干旱對(duì)世界作物產(chǎn)量的影響在諸多因素中占據(jù)首位，其危害程度相當(dāng)于其他災(zāi)害之和。在干旱脅迫條件下，植物會(huì)受到滲透脅迫和氧化脅迫傷害，因此提高植物的滲透調(diào)節(jié)能力和抗氧化能力在提高植物的抗旱性方面具有重要的作用。在干旱脅迫條件下，植物體內(nèi)會(huì)積累多種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以維持植物體內(nèi)的水分平衡。其中甜菜堿在調(diào)節(jié)植物的滲透平衡方面具有重要作用。在一些高等植物中甜菜堿的合成由膽堿單氧化酶(CMO)和甜菜堿醛脫氫酶(BADH)催化

2、合成。因此，通過(guò)基因工程的手段將合成甜菜堿的關(guān)鍵酶基因—Badh導(dǎo)入植物體中并過(guò)量表達(dá)對(duì)于提高植物的抗旱性將具有重要的作用。過(guò)氧化氫酶(CAT)作為植物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的一種關(guān)鍵酶，可以有效清除植物體內(nèi)產(chǎn)生的H2O2，從而在植物的抗氧化方面具有重要的作用。另外，CAT在植物體內(nèi)主要存在于過(guò)氧化物體中，而葉綠體中不含有CAT，但是在干旱等脅迫條件下，作為植物光合作用器官的葉綠體是產(chǎn)生活性氧的主要部位，活性氧的積累將嚴(yán)重?fù)p害葉綠體，對(duì)植物造成

3、傷害。因此，如果能夠利用基因工程的手段將CAT定向?qū)肴~綠體中將對(duì)于提高植物的抗旱性同樣具有重要作用。 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉圓盤(pán)轉(zhuǎn)化法將Cat導(dǎo)入已經(jīng)轉(zhuǎn)入Badh的煙草中，并將Cat與葉綠體RuBP羧化酶小亞基轉(zhuǎn)運(yùn)肽(rbcS-3)基因(Tr)融合，使其能夠定向?qū)肴~綠體中發(fā)揮作用。在含有50mg/L潮霉素的培養(yǎng)基上篩選獲得單轉(zhuǎn)Cat煙草和轉(zhuǎn)Badh、Cat煙草各30多個(gè)株系，并對(duì)其進(jìn)行了分子生物學(xué)的驗(yàn)證和生理指標(biāo)的檢測(cè)。P

4、CR、RT-PCR、植株總蛋白Westernblot和葉綠體蛋白Westernblot結(jié)果表明，目的基因已經(jīng)整合到煙草基因組中，并能正常表達(dá)，且在葉綠體rbcS-3轉(zhuǎn)運(yùn)肽的作用下能定向進(jìn)入葉綠體中。 Cat在煙草中的過(guò)量表達(dá)提高了煙草的抗旱性和抗氧化性，用20％PEG6000模擬干旱和不同濃度百草枯處理誘發(fā)氧化脅迫，結(jié)果如下： 1，在20％PEG6000模擬干旱條件下，轉(zhuǎn)Badh、轉(zhuǎn)Cat和轉(zhuǎn)Badh、Cat煙草的質(zhì)膜損

5、傷程度、葉綠素降解程度和PSⅡ的損傷程度都小于野生型煙草，表明轉(zhuǎn)Badh和Cat提高了植物的抗旱性。另外，結(jié)果表明轉(zhuǎn)Badh、Cat煙草的抗旱性要高于單轉(zhuǎn)Badh煙草和單轉(zhuǎn)Cat煙草。 2，經(jīng)不同濃度百草枯處理后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)Badh、轉(zhuǎn)Cat和轉(zhuǎn)Badh、Cat煙草的抗氧化性高于野生型煙草的抗氧化性，且雙轉(zhuǎn)Badh、Cat煙草的抗性高于單轉(zhuǎn)Badh煙草和單轉(zhuǎn)Cat煙草的抗性。 總之，轉(zhuǎn)Badh和轉(zhuǎn)Cat提高了轉(zhuǎn)基因煙草的抗氧