基于VDR調(diào)控NF-κB信號(hào)通路探討銀屑Ⅰ號(hào)治療尋常型銀屑病的作用機(jī)制.pdf

1、目的:
　　1.觀察尋常型銀屑病患者皮損組織VDR、NF-κB、IκB蛋白表達(dá)差異，分析蛋白表達(dá)差異與疾病嚴(yán)重程度、中醫(yī)辨證分型的相關(guān)性，為中醫(yī)辨證分型及臨床用藥提供客觀參考依據(jù)。
　　2.觀察不同濃度銀屑Ⅰ號(hào)含藥血清對(duì)TNF-a誘導(dǎo)銀屑病細(xì)胞模型細(xì)胞因子(25HVD3、INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22)及VDR、NF-κB、IκB蛋白、基因表達(dá)水平的影響，以初步闡明銀屑Ⅰ號(hào)治療尋常型銀屑病的作用機(jī)制，

2、為銀屑Ⅰ號(hào)的臨床推廣提供理論依據(jù)。
　　3.腺病毒轉(zhuǎn)染法構(gòu)建穩(wěn)定VDR-/-Hacat細(xì)胞株，觀察不同濃度銀屑Ⅰ號(hào)含藥血清對(duì)靶基因沉默的Hacat細(xì)胞模型細(xì)胞因子及VDR、NF-κB、IκB蛋白、基因表達(dá)水平的影響，以深入探討銀屑Ⅰ號(hào)抑制炎癥反應(yīng)的作用靶點(diǎn)，為課題組后期深層次研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　臨床研究部分
　　本課題參考尋常型銀屑病的中西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)共納入病例102人，并進(jìn)行中醫(yī)辨證，入組患者均來(lái)源于

3、廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科門診及住院部，正常人皮膚組織由廣大整形美容醫(yī)院整形外科提供。患者簽署知情同意書后，參考銀屑病皮損面積及嚴(yán)重程度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)行銀屑病面積及嚴(yán)重程度指數(shù)(Psoriasis Area and SeverityIndex，PASI)評(píng)分，分別對(duì)入組病例行組織病理染色及免疫組織化學(xué)檢測(cè)。采用Image-proplus6.0圖像分析軟件測(cè)定目標(biāo)蛋白(VDR、NF-κB、IκB)積分光密度(integral optica

4、l density，IOD)。比較正常組、銀屑病組VDR、NF-κB、IκB蛋白表達(dá)差異，分析蛋白表達(dá)與PASI評(píng)分的相關(guān)性;比較血熱證、血虛證、血瘀證各組VDR、NF-κB、IκB蛋白表達(dá)差異。
　　實(shí)驗(yàn)研究部分
　　1.銀屑Ⅰ號(hào)含藥血清對(duì)銀屑病細(xì)胞模型的影響分組:空白組(BG)、模型組(MG)、銀屑Ⅰ號(hào)低劑量組(LD)、銀屑Ⅰ號(hào)中劑量組(MD)、銀屑Ⅰ號(hào)高劑量組(HD)，其中空白組不予造模，按照常規(guī)操作細(xì)胞培養(yǎng)及藥物干預(yù)

5、，MG、LD、MD、HD各組均予TNF-a誘導(dǎo)造模，并予相應(yīng)血清培養(yǎng)。分別采用酶聯(lián)免疫吸附法(ElISA)檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清25HVD3、INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22濃度;實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)各組VDRmRNA、NF-κBmRNA、Iκ BmRNA表達(dá)水平;蛋白印跡法(Western Blot)檢測(cè)Hacat細(xì)胞VDR、NF-κB、IκB蛋白表達(dá)水平。
　　2.VDR-/-細(xì)胞模型構(gòu)建及驗(yàn)證分組

6、:VDR-NC組、VDR-433組、VDR-544組、VDR-775組，慢病毒質(zhì)粒均由蘇州吉瑪提供，遵照慢病毒轉(zhuǎn)染步驟轉(zhuǎn)染Hacat細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察病毒轉(zhuǎn)染效率，RT-PCR、Western Blot法檢測(cè)各組細(xì)胞VDR基因、蛋白表達(dá)量，篩選出優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)定VDR-/-Hacat細(xì)胞株。
　　3.對(duì)照質(zhì)粒及VDR775質(zhì)粒對(duì)Hacat細(xì)胞的影響分組:空白組(BG)、模型組(MG)、對(duì)照質(zhì)粒+模型組(NC-MG)、VDR775質(zhì)粒+

7、模型組(si-MG)，ELISA法檢測(cè)各組培養(yǎng)細(xì)胞模型構(gòu)建及驗(yàn)證上清細(xì)胞因子濃度，RT-PCR、Western Blot法檢測(cè)各組VDR、NF-κB、IκB基因、蛋白表達(dá)量。
　　4.銀屑Ⅰ號(hào)含藥血清對(duì)VDR沉默前后Hacat細(xì)胞的影響分組:對(duì)照質(zhì)粒+空白組(NC-BG)、對(duì)照質(zhì)粒+模型組(NC-MG)、對(duì)照質(zhì)粒+銀屑Ⅰ號(hào)低劑量組(NC-LD)、對(duì)照質(zhì)粒+銀屑Ⅰ號(hào)中劑量組（NC-MD）、對(duì)照質(zhì)粒+銀屑Ⅰ號(hào)高劑量組(NC-HD)、V

8、DR775質(zhì)粒+空白組(si-BG)、VDR775質(zhì)粒+模型組(si-MD）、VDR775質(zhì)粒+銀屑Ⅰ號(hào)低劑量組(si-LD)、VDR775質(zhì)粒+銀屑Ⅰ號(hào)中劑量組(si-MD）、VDR775質(zhì)粒+銀屑Ⅰ號(hào)高劑量組(si-HD)，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)24h，ELISA法檢測(cè)各組培養(yǎng)上清細(xì)胞因子濃度，RT-PCR、Western Blot法檢測(cè)各組VDR、NF-κB、IκB基因、蛋白表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　　臨床研究部分
　　1.

9、銀屑病皮損組織VDR、IκB蛋白表達(dá)明顯低于正常組織（P＜0.01)，NF-κB蛋白表達(dá)明顯高于正常組織（P＜0.01）;且VDR蛋白表達(dá)量與PASI評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.474，P=0.000)，NF-κB、IκB表達(dá)量與PASI呈正相關(guān)(r=0.093，P=0.325;r=0.037，P=0.713)。
　　2.血熱組NF-κB表達(dá)量明顯高于血虛組、血瘀組;血瘀組VDR表達(dá)明顯高于血熱組、血虛組，NF-κB、IκB表達(dá)明顯低

10、于血熱組、血虛組;血虛組VDR表達(dá)量明顯低于血熱組、血瘀組。
　　實(shí)驗(yàn)研究部分
　　1.銀屑Ⅰ號(hào)含藥血清對(duì)銀屑病細(xì)胞模型的影響
　　與BG組比較，MG組25HVD3水平顯著降低(P＜0.01)，INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22水平顯著升高（P＜0.01);VDR、IκB蛋白及基因表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01)，NF-κB蛋白及基因表達(dá)水平明顯升高(P＜0.01)。與MG組比較，LD、MD、HD組

11、25HVD3水平顯著升高（P＜0.01），INF-γ、IL-1、IL-4、IL-22水平顯著降低（P＜0.01)，MD、HD組IL-17顯著降低（P＜0.01);LD、MD、HD組VDR、IκB蛋白表達(dá)均明顯升高（P＜0.05)，NF-κB蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.01); MD、HD組VDRmRNA表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.05)，MD、HD組NF-κ B mRNA表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)，LD、MD、HD組Iκ BmRNA

12、表達(dá)水平均明顯升高(P＜0.05)。
　　2.VDR-/-細(xì)胞模型構(gòu)建及驗(yàn)證
　　采用VDR775質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，VDR基因、蛋白表達(dá)水平均低于其他質(zhì)粒;MOI=100時(shí)，VDR775質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率最高，MOI=300時(shí)，VDR NC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率最高。
　　3.對(duì)照質(zhì)粒及VDR775質(zhì)粒對(duì)Hacat細(xì)胞的影響
　　與BG組比較，MG組25HVD3水平顯著降低（P＜0.01)，INF-γ、IL-1、IL-4、IL-1

13、7、IL-22水平顯著升高（P＜0.01);NF-κ B、IκB蛋白及基因表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01)。與MG組比較，NC-MG組VDR、IκB、NF-κB蛋白及基因表達(dá)水平無(wú)明顯變化(P＞0.05)，細(xì)胞因子表達(dá)水平無(wú)顯著變化(P＞0.05);與NC-MG組比較，si-MG組25HVD3水平顯著降低（P＜0.01)，INF-γ、IL-1、IL-17、IL-22水平顯著升高（P＜0.01)，VDR、IκB蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.0

14、1)，VDRmRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.01），NF-κB蛋白、基因表達(dá)明顯升高（P＜0.01)。
　　4.銀屑Ⅰ號(hào)含藥血清對(duì)VDR沉默前后Hacat細(xì)胞的影響
　　①銀屑Ⅰ號(hào)含藥血清對(duì)對(duì)照質(zhì)粒干預(yù)Hacat的影響與NC-BG組比較，NC-MG組25HVD3水平顯著降低（P＜0.01)，INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22水平顯著升高（P＜0.01），VDR、IκB蛋白及基因表達(dá)水平均明顯降低(P＜0.0

15、1)，NF-κB蛋白、基因表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01)。與NC-MG組比較，NC-LD組INF-γ、IL-1、IL-4顯著降低（P＜0.05)，NF-κB顯著降低(P＜0.01)，IκB明顯升高（P＜0.01);NC-MD組25HVD3明顯升高（P＜0.01)，INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17水平顯著降低（P＜0.01)，VDR、IκB蛋白及基因表達(dá)顯著升高（P＜0.05)，NF-κB蛋白及基因表達(dá)顯著降低(P＜0.05)

16、; NC-HD組25HVD3明顯升高(P＜0.01)，INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17水平顯著降低（P＜0.01)，VDR、IκB蛋白及基因表達(dá)顯著升高（P＜0.01)，NF-κB蛋白及基因表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。
　?、阢y屑Ⅰ號(hào)含藥血清對(duì)VVDR沉默前后Hacat的影響與si-BG組比較，si-MG組25HVD3明顯降低（P＜0.01)，INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22明顯升高（P＜0.01

17、），VDR、IκB蛋白及基因表達(dá)顯著升高（P＜0.01)，NF-κB蛋白及基因表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。與si-MG組比較，si-LD組25HVD3明顯升高（P＜0.01），INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17明顯降低（P＜0.05)，VDR蛋白及基因顯著升高（P＜0.05)，NF-κB蛋白及基因表達(dá)顯著降低（P＜0.05);si-MD組25HVD3明顯升高（P＜0.01），INF-γ、IL-4、IL-17、IL-22顯著降低

18、（P＜0.05)，VDR、IκB蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05)，NF-κB蛋白及基因表達(dá)顯著降低（P＜0.01)，Iκ BmRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.01);si-HD組25HVD3明顯升高（P＜0.01)，INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22顯著降低（P＜0.05)，VDR蛋白及基因表達(dá)顯著升高（P＜0.01)，NF-κB蛋白及基因表達(dá)顯著降低（P＜0.01)，Iκ BmRNA顯著升高（P＜0.01）。
　

19、?、坫y屑Ⅰ號(hào)含藥血清對(duì)VDR沉默前后Hacat細(xì)胞的影響與對(duì)應(yīng)NC組比較，si-BG組INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22顯著升高（P＜0.01），VDR蛋白、基因表達(dá)降低（P＜0.01）;si-MG組25HVD3明顯降低（P＜0.01)，INF-γ、IL-1、IL-17、IL-22顯著升高（P＜0.01)，VDR蛋白、基因表達(dá)降低（P＜0.05)，NF-κB蛋白及基因表達(dá)顯著升高（P＜0.05);si-LD組25HV

20、D3明顯降低（P＜0.01），INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22顯著升高（P＜0.05)，VDR蛋白、基因表達(dá)降低（P＜0.01)，NF-κB蛋白及基因表達(dá)顯著升高（P＜0.05)，IκB蛋白顯著升高（P＜0.01);si-MD組25HVD3明顯降低（P＜0.01)，INF-γ、IL-1、IL-17、IL-22顯著升高（P＜0.05)，VDR蛋白、基因表達(dá)降低（P＜0.05)，NF-κB蛋白及基因表達(dá)顯著升高（P＜0

21、.01）;si-HD組25HVD3明顯降低（P＜0.01)，INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22顯著升高（P＜0.05)，VDR蛋白、基因表達(dá)降低（P＜0.01)，NF-κB蛋白及基因表達(dá)顯著升高（P＜0.01);Iκ BmRNA蛋白顯著降低（P＜0.01）。
　　結(jié)論:
　　1.尋常型銀屑病皮損中VDR、IκB表達(dá)量低于正常人，NF-κB高于正常人，且蛋白表達(dá)與中醫(yī)辨證分型存在相關(guān)性，VDR信號(hào)抑制可能是

22、銀屑病發(fā)生、發(fā)展的重要原因，蛋白差異表達(dá)可為臨床辨證及用藥提供參考依據(jù)。
　　2.銀屑Ⅰ號(hào)可促進(jìn)生化因子25HVD3表達(dá)，抑制炎癥因子INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22濃度水平，其作用機(jī)制可能與調(diào)控VDR信號(hào)、NF-κB信號(hào)表達(dá)水平有關(guān)。
　　3.VDR775質(zhì)?？沙晒D(zhuǎn)染Hacat細(xì)胞，顯著抑制VDR蛋白、基因表達(dá)水平，VDR NC質(zhì)粒對(duì)銀屑病細(xì)胞模型生化功能無(wú)顯著影響。
　　4.成功構(gòu)建野生型V