葛根素預(yù)處理對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞自噬的影響及其分子機(jī)制.pdf

1、心血管病死亡占城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位，而其中又以冠心病為主。急性心肌梗死(Acute myocardial infarction，AMI)是冠心病中最為危險的類型，其近年來的死亡率總體亦呈現(xiàn)上升態(tài)勢，而及時對患者進(jìn)行溶栓或行經(jīng)皮冠狀動脈介入治療，恢復(fù)缺血心肌的血液灌流是最為有效的治療措施。然而在缺血心肌恢復(fù)血流灌注的過程亦會引起組織損傷和功能障礙，稱為缺血再灌注（Ischemia/Reperfusion，I/R）損傷，多表現(xiàn)為嚴(yán)重的心

2、律失常、心肌梗死面積擴(kuò)大、心肌舒縮功能障礙及微循環(huán)功能紊亂等情況。因此，如何防治、減輕I/R損傷是降低AMI死亡率的關(guān)鍵之一。學(xué)術(shù)界對心肌I/R損傷機(jī)制的研究已有數(shù)十年的歷史，目前較為公認(rèn)的理論包括氧自由基學(xué)說、鈣超載學(xué)說、炎癥學(xué)說以及能量代謝障礙學(xué)說。但至今為止，引起心肌I/R損傷的機(jī)制仍無確切定論。
　　自噬是一種在細(xì)胞水平內(nèi)對受損或不必要的蛋白以及細(xì)胞器進(jìn)行降解的保守過程，被稱為亞細(xì)胞水平的“自我吞食”，在近十多年來受到了極

3、大的關(guān)注。以往的研究表明，自噬作為一種保護(hù)性的細(xì)胞內(nèi)過程，對受損蛋白、細(xì)胞器進(jìn)行控制、降解，是細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的守護(hù)者。真核生物主要存在三種類型的自噬，即巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬，它們之間在作用機(jī)理上是不同的。巨自噬指部分細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞器被隔離到一種從頭合成的稱為自噬體的雙層膜囊泡中，隨后閉合的自噬體與溶酶體融合成為自噬溶酶體并降解其內(nèi)容物，降解后產(chǎn)生的物質(zhì)被用于能量、糖原及蛋白質(zhì)合成的過程。本文此后所稱的自噬均指巨自噬。在各種脅迫條件

4、下，如營養(yǎng)缺乏、氧化應(yīng)激和缺血性損傷，細(xì)胞可以通過誘導(dǎo)自噬來減輕脅迫條件帶來的不良影響。然而，新的研究發(fā)現(xiàn)過高的自噬水平會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的一些必需蛋白或細(xì)胞器被降解，進(jìn)而導(dǎo)致自噬性細(xì)胞死亡。不同程度的自噬導(dǎo)致完全相反作用的現(xiàn)象反映了細(xì)胞自噬的復(fù)雜性。新近研究表明，自噬同樣存在于心肌I/R損傷的過程中，并被認(rèn)為是導(dǎo)致心肌的I/R損傷的機(jī)制之一。正常狀態(tài)下，自噬在心臟中的表達(dá)水平較低，基礎(chǔ)水平的細(xì)胞自噬對于維持心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能等胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)非常

5、重要。在心肌缺血階段，細(xì)胞的能量供應(yīng)缺乏，下降的AMP/ATP比值會激活A(yù)MPK-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。自噬通過降解不必要的蛋白或細(xì)胞器為細(xì)胞提供能量并減輕氧化應(yīng)激，從而起到保護(hù)心肌作用。但是在心肌再灌注階段，由于氧化應(yīng)激等原因，細(xì)胞自噬水平較缺血階段進(jìn)一步上升，過度激活自噬降解了細(xì)胞的必需蛋白和細(xì)胞器，反而加重了細(xì)胞損傷，引起自噬性死亡。自噬在心肌I/R過程中不同時期的不同作用也引起了自噬是有益還是有害的爭論?？偟膩?/p>

6、說，對心肌I/R過程中的自噬進(jìn)行調(diào)控將是減輕I/R損傷的潛在方法。
　　葛根素(Puerarin，Pur)是從野葛根部中提取出來的一種異黃酮類化合物，是提取物中的主要活性成分之一。其化學(xué)名為8-β-D-葡萄吡喃糖-4'，7-二羥基異黃酮，相對分子質(zhì)量為416.38。由于其藥理作用廣泛，并且具有藥物來源豐富、價格較低等特點，在中國被廣泛用于治療心血管疾病、腦血管疾病、帕金森病以及糖尿病等疾病已有20多年。既往研究顯示葛根素可以減輕心

7、肌I/R損傷，表現(xiàn)為減少耗氧量和乳酸產(chǎn)生、減輕心肌梗死面積以及提高心肌收縮能力。而新近的研究表明這些保護(hù)作用與抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放、激活線粒體中ATP敏感性鈣通道、開放鈣激活的鉀通道及激活蛋白激酶C等機(jī)制相關(guān)。盡管已有不少專注于葛根素藥理活性的研究，但是對于葛根素減輕心肌I/R損傷的機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。
　　磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，

8、對處于應(yīng)激狀態(tài)的細(xì)胞尤為重要。相關(guān)研究顯示在不同的模型中，如腦I/R模型，葛根素可以通過激活PI3K/Akt信號通路發(fā)揮其保護(hù)作用。而PI3K/Akt信號通路也是調(diào)控自噬的重要通路之一，該通路的激活可以產(chǎn)生抑制自噬的效果。PI3K/Akt和抑制自噬之間的主要聯(lián)系是mTOR信號通路，后者是一種進(jìn)化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于Ⅰ類PI3K家族，并能調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和代謝。mTOR存在兩種不同的復(fù)合物形式:參與調(diào)控自噬的復(fù)合物1(m

9、TORC1)和復(fù)合物2(mTORC2)。在正常生長條件下，當(dāng)細(xì)胞有豐富的生長因子和ATP時，mTORC1會下調(diào)自噬信號通路和保持一定的基礎(chǔ)水平的自噬作用。然而在饑餓條件下，mTORC1的功能被抑制，進(jìn)而激活自噬。PI3K/Akt信號通路的激活便可通過激活mTORC1來抑制自噬。結(jié)合自噬在心肌缺血再灌注損傷中扮演的重要角色，我們猜測葛根素是否通過激活PI3K/Akt信號通路來抑制心肌I/R過程中過度激活的自噬，進(jìn)而起到心肌保護(hù)作用。對于該

10、問題的研究，將有助于進(jìn)一步理解葛根素減輕心肌I/R損傷機(jī)制，以及明確自噬在心肌I/R過程中所扮演的角色，為減輕心肌I/R損傷提供新的思路與方法。
　　目的:
　　1.通過細(xì)胞活性實驗驗證葛根素對H/R心肌的保護(hù)作用;通過3-MA抑制心肌H/R過程中的自噬，明確自噬在心肌H/R過程中的作用;
　　2.通過免疫印跡實驗檢測自噬標(biāo)志蛋白(LC3、p62)和信號通路相關(guān)蛋白(AMPK、Akt)的表達(dá)，通過透射電鏡和腺病毒轉(zhuǎn)染觀

11、察自噬體數(shù)量的變化，明確葛根素對心肌H/R自噬的作用;
　　3.依據(jù)上一部分的實驗結(jié)果，使用特異性信號通路抑制劑來探索葛根素影響I/R心肌自噬的潛在分子機(jī)制;
　　方法:
　　1.細(xì)胞培養(yǎng):取新生1-2天的SpragueDawley大鼠乳鼠心臟，經(jīng)消化、分離后，以5×105個細(xì)胞/60-mm培養(yǎng)皿的密度接種。細(xì)胞常規(guī)換液、培養(yǎng)4天后進(jìn)行造模。
　　2.缺氧復(fù)氧(Hypoxia/Reoxygenation，H/R)

12、模型:新生大鼠乳鼠心肌細(xì)胞(Neonatal rat cardiomyocytes，NRCs)培養(yǎng)完成后，將細(xì)胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液換成磷磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered saline，PBS），然后將培養(yǎng)皿置于缺氧盒內(nèi)（95％ N2、5％ CO2和＜0.1％ O2），在37.5℃的環(huán)境中缺氧3小時;缺氧完成后，將培養(yǎng)皿內(nèi)的PBS替換成細(xì)胞培養(yǎng)液，并放回細(xì)胞培養(yǎng)箱中復(fù)氧3小時。本研究實驗通過此心肌H/R模型模擬心肌I/R損

13、傷。
　　3.藥物預(yù)處理:葛根素(50，100，200μM)、3-MA(5 mM)、雷帕霉素(0.1μM)、Akt信號通路抑制劑(API-2，10μM)均于H/R前2小時加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，2小時后對細(xì)胞進(jìn)行H/R造模。
　　4.實驗分組:實驗總體分四個部分，有以下五種類型的分組:
　　a)對照組(Control):細(xì)胞僅單純培養(yǎng)，不對其進(jìn)行H/R造模;
　　b)缺氧復(fù)氧組(H/R):細(xì)胞培養(yǎng)完成后，對其進(jìn)行3小時

14、缺氧和3小時復(fù)氧的造模處理;
　　c)葛根素組(Pur):細(xì)胞培養(yǎng)完成后，加入葛根素預(yù)處理2小時，隨后對其進(jìn)行H/R造模;
　　d)雷帕霉素/3-甲基腺嘌呤/Akt信號抑制劑組（Ra/3-MA/API-2）:細(xì)胞培養(yǎng)完成后，加入雷帕霉素/3-甲基腺嘌呤/Akt信號抑制劑預(yù)處理2小時，隨后對其進(jìn)行H/R造模;
　　e)葛根素加雷帕霉素/3-甲基腺嘌呤/Akt信號抑制劑組(Pur+Ra/3-MA/API-2)組:細(xì)胞培養(yǎng)完

15、成后，予葛根素加雷帕霉素/3-甲基腺嘌呤/Akt信號抑制劑預(yù)處理2小時，隨后對其進(jìn)行H/R造模;
　　5.檢測指標(biāo):MTS法檢測細(xì)胞活性;蛋白印跡法檢測自噬標(biāo)志蛋白（LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ、p62）和信號通路相關(guān)蛋白(p-Akt/Akt、p-AMPK/AMPK)的表達(dá);透射電鏡觀察自噬體形態(tài)及數(shù)量;LC3熒光雙標(biāo)腺病毒（Ad-mRFP-GFP-LC3）轉(zhuǎn)染觀察自噬體及自噬溶酶體的變化。
　　結(jié)果:
　　1.與Contr

16、ol組相比，H/R組細(xì)胞活性下降至38.4％±2.8％;相較H/R組，Pur(50，100，200μM)以及3-MA預(yù)處理均可減少細(xì)胞活性損失，提示葛根素與3-MA預(yù)處理對H/R心肌起到保護(hù)作用;
　　2.與Control組相比，H/R組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯升高，p62降低，提示心肌H/R模型中自噬水平明顯升高。相較H/R組，Pur組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低，p62升高，提示葛根素預(yù)處理可以抑制心肌H/R過程中的自

17、噬;
　　3.透射電鏡:Control組中只發(fā)現(xiàn)極少量的自噬體，與之相比，H/R組中自噬體大量增加;與H/R組相比，Pur組的自噬體數(shù)量明顯減少;
　　4.Ad-mRFP-GFP-LC3轉(zhuǎn)染:與Control組相比，H/R組黃點（自噬體）、紅點（自噬溶酶體）明顯增加;相較H/R組，Pur組黃點（自噬體）明顯減少，而紅點（自噬溶酶體）數(shù)量無明顯差異。
　　5.相較H/R組，Pur組p-Akt/Akt比值升高，而p-AMP

18、K/AMPK比值無明顯差異，提示葛根素在心肌H/R過程中激活A(yù)kt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路;
　　6.與H/R組相比，Ra組及API-2組自噬水平均明顯升高，API-2組的p-Akt/Akt比值明顯下降;與Pur組相比，Pur+Ra組自噬水平無明顯差異，Pur+API-2組自噬水平明顯升高，提示API-2可以阻斷葛根素的自噬抑制作用。
　　結(jié)論:
　　1.葛根素預(yù)處理可以通過抑制自噬體形成來減輕心肌H/R損傷。
　　2.Ak