甘丙肽對神經(jīng)干細(xì)胞、PC12細(xì)胞和B104細(xì)胞增殖的作用研究.pdf

1、甘丙肽(Galanin，GAL)是一個29-30個氨基酸的?；窠?jīng)肽。它廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)損傷修復(fù)起到一定的調(diào)節(jié)作用。在神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)損傷修復(fù)過程中，神經(jīng)細(xì)胞的增殖是重要環(huán)節(jié)，本文運(yùn)用幾種可增殖神經(jīng)類細(xì)胞(神經(jīng)干細(xì)胞、PC12細(xì)胞、B104細(xì)胞)，檢測GAL及其受體(GalR1、GalR2和GalR3)在該類細(xì)胞中的表達(dá)特性，并探討GAL對該類細(xì)胞增殖的影響。由此推測它在中樞系統(tǒng)中可能起到的調(diào)節(jié)作用。實驗分四部分

2、： 第一部分，分離E14 SD大鼠胚胎的前腦室下帶(SVZ)區(qū)域的細(xì)胞，接種于含bFGF、B27的DMEM/F12的無血清培養(yǎng)基中。用Nestin單克隆抗體檢測未分化的細(xì)胞。在誘導(dǎo)細(xì)胞分化后，分別進(jìn)行MAP2、 GFAP、 CNP免疫組化檢測，分別鑒定神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞多種分化細(xì)胞。確定獲得的是神經(jīng)干細(xì)胞。同時，培養(yǎng)PC12細(xì)胞和B104細(xì)胞，為進(jìn)行后面的研究提供穩(wěn)定的細(xì)胞來源。 第二部分，為了檢測體

3、外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞，PC12細(xì)胞和B104細(xì)胞是否表達(dá)GAL及其三種受體——GalR1、GalR2和GalR3，實驗中運(yùn)用RT-PCR方法來檢測GAL及其三種受體mRNA的表達(dá)。再用免疫熒光化學(xué)的方法來檢測GAL蛋白的表達(dá)。 第三部分，為了初步了解GAL對神經(jīng)干細(xì)胞，PC12細(xì)胞，B104細(xì)胞的影響，首先，實驗中運(yùn)用MTT法來檢測不同濃度的GAL及其受體激動劑(GAL1-11和GAL2-11)和拮抗劑(M35)對三種細(xì)胞增殖的

4、影響。 第四部分，采用TUNEL法進(jìn)一步檢測GAL是否引起了神經(jīng)干細(xì)胞的凋亡。通過乳酸脫氫酶檢測，看GAL是否引起神經(jīng)干細(xì)胞凋亡。 實驗結(jié)果： 1)經(jīng)過上述分離與純化細(xì)胞的方法，我們成功地獲得能夠穩(wěn)定的生長，具有神經(jīng)干細(xì)胞特征，并具有多分化潛能的細(xì)胞。獲得了穩(wěn)定的PC12和B104細(xì)胞系。 2)神經(jīng)干細(xì)胞不僅有GAL的表達(dá)還有所有三種GAL受體的表達(dá)：PC12細(xì)胞表達(dá)所有三種GAL受體，而不表達(dá)G

5、AL；B104細(xì)胞表達(dá)GAL及兩種受體GalR2和GalR3，而不表達(dá)GalR1。 3)GAL及其激動劑可抑制體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞和PCl2細(xì)胞的增殖，卻對B104細(xì)胞的增殖起到促進(jìn)作用。非特異性受體阻斷劑M35單獨作用不影響細(xì)胞的增殖，卻能阻斷GAL及其激動劑的作用。 4)GAL并非通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而對神經(jīng)干細(xì)胞的增殖起到抑制作用。GAL并沒有引發(fā)細(xì)胞壞死等毒性作用。所以推測GAL是通過延緩細(xì)胞增殖周期而對神經(jīng)干細(xì)

6、胞的增殖產(chǎn)生抑制作用。 綜上所述，我們從E14 SD大鼠胚胎的前腦室下帶(SVZ)分離純化得到了純度較高的神經(jīng)干細(xì)胞。利用這種細(xì)胞來研究GAL的作用，結(jié)果說明GAL抑制這種細(xì)胞的增殖，但這種抑制效應(yīng)不是通過引起細(xì)胞的凋亡或死亡而實現(xiàn)的。所以推測GAL是通過延緩細(xì)胞增殖周期而對神經(jīng)干細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用。此外，PC12細(xì)胞和B104細(xì)胞中由于受體表達(dá)不同，介導(dǎo)的GAL的效應(yīng)也不同。說明三種不同的GalRs可能介導(dǎo)不同的作用。