家蠶肌鈣蛋白C基因的研究.pdf

1、肌鈣蛋白C(Troponin C，TnC)是一科EF手圖形超家族蛋白，可以結(jié)合Ca<'2+>并發(fā)揮其生物學功能。它的Ca<'2+>結(jié)合位點是由螺旋-環(huán)-螺旋(HLH)構(gòu)成的EF手圖像模體。肌鈣蛋白C主要存在于肌肉組織中，它在調(diào)節(jié)肌肉收縮方面具有重要作用。目前，國內(nèi)外對肌鈣蛋白C的研究多數(shù)集中在脊椎動物上，而對無脊椎動物的研究較少。 我們通過RT-PCR的方法從家蠶蛹中擴增到家蠶肌鈣蛋白C基因的完整的ORF序列，并將其命名為BmT

2、nC(Bombyx mori troponin C)，GenBank登錄號為DQ675020。該基因序列長為480 bp，編碼159個氨基酸，預測分子量為18.18 kDa。我們將擴增到的BmTnC基因克隆到融合表達載體pET-28a相應的酶切位點上，得到融合蛋白表達質(zhì)粒pET-28a-BmTnC，經(jīng)PCR、酶切鑒定以及測序證明重組子是正確的。將該重組子轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，用終濃度為1 mM的IPTG誘導重組菌后，裂解菌體作

3、SDS-PAGE分析，在21 kDa左右的位置有一條特異性蛋白條帶，與預期值(融合標簽3.56 kDa，BmTnC 18.18 kDa)相符。融合蛋白以可溶性形式存在，故用超聲裂解菌體后12000 rpm離心所得的上清以親和層析的方法純化目的蛋白His-tag BmTnC。經(jīng)FPLC反相柱層析進一步純化后，再進行質(zhì)譜分析，得到該融合蛋白的分子量為21600.9 Da，證實了該蛋白表達的正確性。以純化所得蛋白為抗原免疫雄性新西蘭兔，制備了

4、該重組蛋白的多克隆抗體，ELISA檢測該抗血清的效價可達到1∶25600以上。提取家蠶五齡幼蟲的各組織蛋白，用于Western blotting實驗。實驗結(jié)果表明，BmTnC蛋白在家蠶的表皮、腸道、頭、馬氏管、睪丸等組織中都有表達，且表達量依次降低，而在絲腺和脂肪體中我們并沒有檢測到該蛋白的存在。通過免疫組織化學實驗，我們也發(fā)現(xiàn)該蛋白主要分布在家蠶五齡幼蟲的表皮、氣門、腸道、馬氏管、頭部等組織中，以及蛹的頭部、腸道、體壁等組織中。亞細胞