番茄生長素反應基因的分離與表達分析及SlARF5基因功能的初步研究.pdf

1、作為第一個被發(fā)現(xiàn)的植物激素，生長素在植物生長發(fā)育的各個階段都發(fā)揮著巨大的作用。ARF(Anxin Response Factor)作為一種轉錄因子，在生長素信號傳導中起著關鍵的作用。ARF編碼的蛋白可以通過與生長素反應基因啟動子區(qū)域的生長素反應原件結合來調(diào)節(jié)這些基因的表達。AUX/IAA基因家族的基因編碼的蛋白質(zhì)在生長素信號傳導的過程中通過與ARF基因結合抑制其作用來調(diào)控基因表達。IAA，GH3和SAUR基因的mRNA水平可以迅速被生長

2、素所誘導，因此被稱為生長素原初反應基因。在不時栽培中，在開花結果期如遇逆溫（低溫或高溫）就會發(fā)生授粉受精不良，落花落果等現(xiàn)象，直接導致坐果率下降，畸形果數(shù)量增加，嚴重影響到番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)。而前人的研究表明，生長素相關基因特別是ARF和AUX/IAA基因在番茄果實的單性結實中發(fā)揮著重要的作用。因此，對番茄生長索相關基因的全基因組分析必將為以后研究每個基因的功能以及進一步應用到生產(chǎn)實踐提供依據(jù)。
　　 本研究主要以番茄Micro-

3、Tom品種作為研究對象，主要研究生長素相關的基因在番茄幼果發(fā)育過程中的時空表達特性，構建SIARF5的Artificial MirRNA植物表達載體并進行轉基因工作，獲得了番茄轉基因植株并初步分析S1ARF5在番茄坐果以及果實發(fā)育過程中的作用。本研究旨在探討生長素調(diào)控植物果實坐果和果實發(fā)育的分子機制，為在生產(chǎn)上解決番茄坐果不良等問題尋求重要理論依據(jù)。
　　 主要研究結果如下:
　　 (1)通過搜集其它物種中已經(jīng)公布的AR

4、F基因的氨基酸序列在番茄基因組數(shù)據(jù)庫中進行TBLASN的同源比對。將比對后得到的DNA序列預測去除內(nèi)含子后再通過一系列的包括電子克隆和分子克隆的方法共分離出21個番茄ARF基因。這些基因的堿基序列長度從1218bp(S1ARF12)到3372bp(S1ARF7)不等。21個基因分布在除了9號以外的所有的11條染色體上。大部分的番茄ARF基因包含了DBD、MR和CTD三個功能域。但是S1ARF3,6-1，12-14,13-1和17這7個基

5、因缺失了第三個功能域。進化分析表明21個基因可以分為Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ三組。其中組Ⅰ和組Ⅱ可以進一步細分。表達分析表明S1ARF基因在植株的各個部位表達差異不大，為組成型表達。在花蕊的發(fā)育過程中表現(xiàn)出多樣化的表達模式。在子房的發(fā)育過程中，但部分的基因呈現(xiàn)出先升高后下降的表達模式，但是S1ARF4則是持續(xù)升高。
　　 (2)通過與(1)中相同的方法，從番茄基因組中一共鑒定出了26個AUX/IAA基因。這些基因的堿基長度從228bp(S1I

6、AA13)到1050bp(S1IAA4)不等。26個基因分布在除了2號，10號和11號之外的所有的9條染色體上。大部分的番茄IAA基因包含了所有的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ四個功能域，但是S1IAA13、15、16、18、20和27則缺失了第Ⅰ和Ⅱ兩個功能域。進化分析表明，所有的26個S1IAA因可以細分為A和B兩組，這兩組還可以分別細分成5和3個小組。S1I從基因在植株不同部位的表達差異較大，表達模式比較特異。在花蕊的發(fā)育過程中除了個別的基因(S

7、1IAA16、20、23和24)都表現(xiàn)出持續(xù)上升的模式。而在果實的發(fā)育過程中則表現(xiàn)出了多樣化的表達模式。在激素處理之后，大部分的S1IAA基因都可以被生長素誘導上調(diào)表達，但是S1IAA19和20的表達卻被IAA抑制。在逆境條件下，大部分的S1IAA的表達情況都有變化，但是變化的程度各不相同。
　　 (3)用類似的方法從番茄數(shù)據(jù)庫中鑒定出了32個番茄GH3基因。在這32個基因中有一半左右的成員是長度較小的基因。這是在以前的研究中沒

8、有報道過的。這32個基因分布在除了3號、4號、9號和11號之外的所有的8條染色體上，其中有5個(S1GH3.28-32)在已經(jīng)拼接的基因組數(shù)據(jù)庫中未找到確切的位置。按照前人的報道，這些基因按照進化關系可以分成Ⅰ和Ⅱ兩組。對12條S1GH3進行表達分析表明，GH3在植株的不同部位的表達也是比較特異的?；ㄈ锏陌l(fā)育過程中，不同基因的表達模式差異較大。而在子房的發(fā)育過程中均呈現(xiàn)出先增長后下降的表達模式。大部分的S1GH3基因?qū)ιL素的處理不敏感

9、，只有GH3.18的表達在處理前后表現(xiàn)出了明顯的差異。
　　 (4)用類似的方法從番茄數(shù)據(jù)庫中鑒定出了99個番茄SAUR基因。這些基因堿基的長度在186bp(S1SAUR30)到597bp(S1SAUR54)之間。大部分的基因都簇狀分布在所有的12條染色體上。將所有已經(jīng)公布的SAUR基因以及本研究中新鑒定出來的SAUR基因進行進化分析，所有的484個SAUR基因可以分為A、B、C和D四個大組，以及進一步細分成16個小組。S1SA

10、UR基因在植株的不同部位表達差異明顯。在子房和花蕊的發(fā)育過程中，不同基因的表達模式差異較大。從已經(jīng)公布的所有的SAUR基因的氨基酸序列中，我們找到了26個基因含有組氨酸富集的區(qū)域。特別需要指出的是，S1SAUR58作為一個番茄中組氨酸含量最高的SAUR基因，它的表達可以被干旱脅迫和高溫脅迫抑制，但是卻被鹽脅迫所誘導。S1SAUR也可以明顯的被生長素誘導表達。這些證據(jù)表明S1SAUR58在連接生長素信號和鹽脅迫信號中可能發(fā)揮著特殊的作用。

11、
　　 (5)構建了S1ARF5的人工MirRNA植物表達載體。首先以擬南芥中的miR164a作為骨架，用S1ARF5的特異片段替換掉miR164a上的成熟MirRNA序列。MiR164a至今沒有報道會與ARF互作，排出了番茄中miR164a會與S1ARF5互作的可能。然后將合成的Artificial MirRNA連接入雙元載體pCAMBIA1301-35s，命名為P35s:1031ArtmirRNA ARF5。以pCAMBIM