水稻抗蟲(chóng)相關(guān)基因OsICS和OsHPL3的功能分析.pdf

1、當(dāng)植物受到病原菌及植食性昆蟲(chóng)危害后，會(huì)產(chǎn)生一系列的誘導(dǎo)防御反應(yīng)。在一些雙子葉植物如擬南芥和煙草等中的研究表明，水楊酸和綠葉性氣味分別可作為信號(hào)分子及防御化合物在植物的誘導(dǎo)防御反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。然而，作為單子葉模式植物的水稻，在這方面的研究還很少。為此，我們想通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確在單子葉模式植物水稻中是否也存在著一條異分支酸途徑來(lái)合成水楊酸，以及該途徑在抗蟲(chóng)防御反應(yīng)中究竟發(fā)揮著什么作用？同時(shí)，與作為防御反應(yīng)相關(guān)的重要物質(zhì)茉莉酸競(jìng)爭(zhēng)相

2、同底物的綠葉性氣味在水稻對(duì)白背飛虱的抗性防御反應(yīng)也未見(jiàn)報(bào)道。因此，本文選擇受褐飛虱取食誘導(dǎo)的水稻異分支酸合成酶基因OsICS和合成水稻綠葉性氣味的脂氫過(guò)氧化物裂解酶基因OsHPL3為研究對(duì)象，結(jié)合利用反向遺傳學(xué)、化學(xué)分析、分子生物學(xué)以及生物測(cè)定等研究方法，對(duì)OsICS的抗蟲(chóng)相關(guān)功能及OsHPL3調(diào)控的綠葉性氣味在水稻對(duì)白背飛虱抗性防御反應(yīng)中的作用進(jìn)行了研究，獲得的主要結(jié)果如下:
　　 克隆了異分支酸合成酶基因OsICS,該基因的

3、開(kāi)放閱讀框?yàn)?445bp，編碼一個(gè)由814個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，預(yù)測(cè)分子量為88.024KD，pI值為5.92。OsICS編碼的蛋白定位于葉綠體。組織表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)OsICS的轉(zhuǎn)錄水平在水稻葉內(nèi)要明顯高于水稻中的其它部位;誘導(dǎo)表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)褐飛虱(Nilaparvata lugens，rice brown planthopper, BPH)、白背飛虱(white back planthopper, WBPH)和二化螟（Chilo sup

4、pressalis，rice striped stem borer, SSB）取食、機(jī)械損傷處理均能誘導(dǎo)OsICS基因的表達(dá)，而外源激素茉莉酸(Jasmonic acid，JA)和水楊酸(Salicylicacid, SA)不誘導(dǎo)其表達(dá)，甚至后期有一定的抑制作用。我們利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，獲得了水稻OsICS反義抑制突變體植株，經(jīng)檢測(cè)，該反義純合品系中OsICS的轉(zhuǎn)錄水平比野生型水稻中分別降低了46.23％～50.86％。各品系表型研究結(jié)果

5、表明，OsICS反義突變體植株在水稻萌發(fā)期及溫室內(nèi)種植時(shí)均顯著矮于野生型水稻。同時(shí)，溫室內(nèi)種植的水稻反義品系本底SA含量明顯低于野生型，且室內(nèi)各品系受褐飛虱和二化螟取食誘導(dǎo)后，OsICS反義品系中SA含量也顯著低于野生型水稻。我們接下來(lái)利用該突變體中SA含量的降低，對(duì)不同害蟲(chóng)進(jìn)行了生測(cè)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，反義品系能明顯增加水稻對(duì)BPH和WBPH的選擇性，但產(chǎn)卵量并無(wú)明顯差異，當(dāng)外源SA處理后則可恢復(fù)BPH和WBPH對(duì)突變體的取食選擇性;Os

6、ICS反義品系并不影響蟲(chóng)害誘導(dǎo)的水稻JA、胰蛋白酶抑制劑(trypsinprotease inhibitors，TrypPIs)和乙烯(ethylene，ET)的合成，同時(shí)對(duì)BPH、WBPH的若蟲(chóng)發(fā)育歷期和二化螟的生長(zhǎng)均無(wú)明顯影響。
　　 水稻OsHPL3表達(dá)譜分析表明，機(jī)械損傷、SSB、BPH和WBPH為害均能夠誘導(dǎo)OsHPL3的表達(dá)，而外源激素JA和SA處理對(duì)其無(wú)明顯影響。我們利用相同方法獲得了反義抑制OsHPL3單拷貝純合

7、品系。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，OsHPL3表達(dá)水平的下調(diào)會(huì)引起突變體受機(jī)械損傷和白背飛虱取食誘導(dǎo)的GLV(Z)-3-hexenal、(E)-2-hexenal和(Z)-3-hexen-1-ol的含量顯著下降，該反義突變體明顯提高了水稻對(duì)刺吸式口器害蟲(chóng)WBPH的抗性，可導(dǎo)致WBPH成蟲(chóng)對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻的選擇性、產(chǎn)卵量及取食量均明顯下降。同時(shí)，取食反義品系水稻的WBPH雌雄若蟲(chóng)發(fā)育歷期均顯著延長(zhǎng)，存活率比野生型明顯下降，以反義品系為食的若蟲(chóng)孵化后繼續(xù)在該品系

8、上產(chǎn)卵，其產(chǎn)卵量也顯著低于以野生型植株為食的對(duì)照植株。當(dāng)分別回補(bǔ)不同濃度的GLV后，發(fā)現(xiàn)(Z)-3-hexenal處理能恢復(fù)OsHPL3反義品系對(duì)WBPH的抗性影響。揮發(fā)物測(cè)定結(jié)果表明，反義品系能明顯增加WBPH為害誘導(dǎo)的(+)-limonene，2-heptanol，sesquisabinene和β-sesquiphellandrene的釋放量，其釋放總量也有一定程度增加，但未達(dá)到顯著差異水平，其他揮發(fā)性物質(zhì)的釋放量并無(wú)明顯差異。對(duì)W