轉(zhuǎn)雙價抗紋枯病基因水稻新種質(zhì)創(chuàng)制.pdf

1、由立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kühn)引起的水稻紋枯病與稻瘟病、白葉枯病合稱為水稻三大病害。水稻自然品種中迄今未發(fā)現(xiàn)對該病原菌免疫和高抗的種質(zhì)，依靠傳統(tǒng)育種技術(shù)選育抗病品種的難度較大。本實驗室前期研究顯示，在水稻中分別超表達藥用植物天麻中的一種抗真菌蛋白基因2（GAFP2，Gastrodia Antifungal Protein2）和水稻多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因1（OsPGIP1，Polygalacturon

2、ases inhibiting protein1）均可顯著增強水稻對紋枯病的抗性。進一步聚合兩個基因并優(yōu)化其表達方式，有望篩選出表達更特異的抗紋枯病新種質(zhì)。為此，本研究采用水稻綠色組織特異表達啟動子PrbcS和PcyFBpase分別驅(qū)動OsPGIP1和GAFP2表達，構(gòu)建雙基因植物表達框“PrbcS::OsPGIP1—PcyFBpase::GAFP2”（以下簡稱雙價基因），并采用雙T-DNA植物表達載體進行轉(zhuǎn)化以篩選無標(biāo)記抗紋枯病轉(zhuǎn)基因

3、新種質(zhì)，主要結(jié)果如下:
　　1、在江蘇主栽粳稻品種武運粳24號(WYJ24)和武陵粳1號(WLJ1)中累計獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株131株(T0)，根據(jù)農(nóng)藝表型及育性表現(xiàn)初步篩選，最終保留114個陽性轉(zhuǎn)基因系(T1)，其中WLJ1背景53個，WYJ24背景61個。
　　2、通過Southern Blot對轉(zhuǎn)基因系中的外源基因拷貝數(shù)進行分析，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)轉(zhuǎn)基因系中攜帶外源基因數(shù)為3拷貝及以上，單、雙拷貝轉(zhuǎn)基因系分別僅有15和9個。篩

4、選到靶基因單拷貝的無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因系4個，靶基因單拷貝篩選標(biāo)記也為單拷貝的轉(zhuǎn)基因系5個。對各轉(zhuǎn)基因系中的靶基因表達水平進行RT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)轉(zhuǎn)基因系中的靶基因在葉片中的mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯高于對照品種，且表達水平與拷貝數(shù)間沒有相關(guān)性?；虮磉_部位分析結(jié)果顯示，靶基因主要在葉片、幼穗、葉鞘和莖中強表達，而在根與種子中表達較弱或不表達。通過Western Blot，發(fā)現(xiàn)各單拷貝轉(zhuǎn)基因系中均積累較強的GAFP2蛋白。這些結(jié)果表明，雙價基

5、因成功整合至水稻基因組中且主要在水稻綠色組織中強表達。
　　3、對21個單拷貝和雙拷貝轉(zhuǎn)基因系進行紋枯病菌接種鑒定。田間鑒定結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)基因系的發(fā)病情況總體輕于對照，病級差異達到顯著水平;相對于對照品種，轉(zhuǎn)基因系的病級平均最少降低了0.3級，最高降低了2.8級，平均減輕1.6級。部分轉(zhuǎn)基因系進行了室內(nèi)離體接種鑒定，結(jié)果顯示，多數(shù)轉(zhuǎn)基因系的病斑長度顯著短于對照品種。室內(nèi)離體鑒定與田間鑒定結(jié)果趨勢基本一致。這些結(jié)果表明，本研究中的雙價

6、基因確實可顯著增強水稻對紋枯病的抗性。
　　4、初步考察了21個轉(zhuǎn)基因株系的主要農(nóng)藝性狀和生育期，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)株系與對照相比在一個或多個性狀上存在一定的差異，但不同轉(zhuǎn)化子間很少出現(xiàn)一致的性狀變異，表明多數(shù)轉(zhuǎn)化子后代株系的性狀可能是由組培變異引起的，而不是外源基因直接引起的。通過篩選，獲得了少數(shù)與對照親本基本接近或綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)異的轉(zhuǎn)基因系。
　　5、采用反向PCR策略對13個單拷貝轉(zhuǎn)基因系中的靶基因插入位置進行分析，共獲得5個