3個(gè)群體刺參遺傳多樣性分析及AIF-1基因克隆與表達(dá).pdf

1、刺參(Apostichopus japonicus)隸屬于棘皮動(dòng)物門,廣泛分布于太平洋西部的中國(guó)、俄羅斯、朝鮮、韓國(guó)與日本沿海,具有較高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值,是我國(guó)重要的養(yǎng)殖種類之一。近年來(lái),由于刺參養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大,個(gè)體生長(zhǎng)速度緩慢、抗病力能力下降、疾病頻發(fā)等問(wèn)題,制約了刺參養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。因此對(duì)刺參遺傳多樣性、免疫相關(guān)基因應(yīng)答機(jī)制進(jìn)行研究,可為刺參種質(zhì)改良和疾病預(yù)防提供參考依據(jù)。
　　本研究利用核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1(ITS1)和線

2、粒體D-loop區(qū)序列多態(tài)性分析了3個(gè)不同地理群體刺參的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu);同時(shí)克隆測(cè)序了刺參免疫相關(guān)基因同種異體移植炎癥因子-1(Allograft inflammatory factor-1,AIF-1)全長(zhǎng)cDNA,并分析該基因在刺參不同組織、燦爛弧菌(Vibrio splendidus)及組織創(chuàng)傷刺激后的表達(dá)模式。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)利用核糖體DNA第一內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS1)序列,對(duì)中國(guó)大連(CD)、朝鮮羅津

3、(KN)和俄羅斯海參崴(RV)3個(gè)野生群體刺參的遺傳多樣性進(jìn)行分析。經(jīng)PCR擴(kuò)增、克隆測(cè)序,獲得長(zhǎng)度為517-519bp、524bp兩種類型的ITS1核苷酸序列,平均G+C含量(64.5％)顯著高于A+T含量。在刺參30個(gè)個(gè)體61條序列中共檢測(cè)49個(gè)變異位點(diǎn),多態(tài)位點(diǎn)比例為9.33％,其中4個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn),共有40種基因型,群體共享基因型為2個(gè)。遺傳多樣性分析表明,3個(gè)群體遺傳多樣性豐富;分子方差分析(AMOVA)顯示,88.65％的變

4、異來(lái)自于群體內(nèi)部,群體間遺傳分化較弱或中度分化。根據(jù)群體間遺傳距離進(jìn)行聚類分析,發(fā)現(xiàn)KN群體與RV群體親緣關(guān)系較近,CD群體KN、RV群體親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
　　(2)刺參CD、KN和RV群體遺傳多樣性的D-loop分析:對(duì)3個(gè)群體共計(jì)71頭刺參的線粒體D-loop序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序,獲得長(zhǎng)度為447-465bp的D-loop序列,平均A+T含量(59.2％)顯著高于G+C含量;共檢測(cè)到119個(gè)變異位點(diǎn),多態(tài)位點(diǎn)比例為24.24

5、％,其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)為53個(gè),共有40種基因型,其中7個(gè)基因型被3個(gè)群體共享。群體遺傳多樣性參數(shù)分析表明3個(gè)群體遺傳多樣性比較豐富;利用Arlequin3.5分子方差(AMOVA)分析結(jié)果表明,3個(gè)群體間遺傳分化較弱或只有中度分化,群體分化時(shí)間為19.68-22.1萬(wàn)年前。CD群體與RV群體之間遺傳距離最遠(yuǎn)為0.042,KN群體與RV群體之間遺傳距離最近為0.0374。將本研究所得序列結(jié)合GenBank中青島(QD)和威海(WH)仿刺參

6、的D-loop序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,QD與WH刺參首先聚為一小支,然后與CD群體聚為一大支,KN群體與RV群體聚為獨(dú)立一支,這一聚類方式符合地理隔離模式。
　　(3)采用RACE技術(shù)克隆了刺參AIF-1基因的全長(zhǎng)cDNA序列,該序列全長(zhǎng)1541bp,含有一個(gè)477bp的開放閱讀框,編碼158個(gè)氨基酸,蛋白計(jì)算分子量為17.92kDa,等電點(diǎn)為4.91,另外該基因還具有2個(gè)EF-手型鈣離子結(jié)合基序。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析該基因