兩種天然產(chǎn)物的生物活性研究.pdf

1、通過對(duì)課題組近年來分離得到的化合物進(jìn)行活性篩選，發(fā)現(xiàn)高圣草素具有良好的細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用;澤瀉醇B-23-乙酸酯具有顯著地肺癌細(xì)胞增殖抑制活性，對(duì)這兩種天然產(chǎn)物展開了較為深入的活性研究。
　　氧化應(yīng)激是導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷進(jìn)而引發(fā)多種血管疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化、慢性腎病等的主要因素。氧化應(yīng)激的產(chǎn)生是由于細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)和氧化因素—如活性氧(ROS)之間的失衡所致。應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激引起的氧化損傷的有效方法之一是啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化系

2、統(tǒng)。核因子E2相關(guān)因子2/抗氧化反應(yīng)元件(Nrf2/ARE)信號(hào)通路是機(jī)體應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激的第一道防線，激活該信號(hào)通路可以幫助細(xì)胞重建內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)，維持穩(wěn)定的氧化還原平衡。Nrf2是細(xì)胞維持內(nèi)源性氧化還原平衡的主要轉(zhuǎn)錄因子。氧化應(yīng)激條件下，Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核與其靶基因啟動(dòng)端抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element, ARE）結(jié)合，啟動(dòng)Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的表達(dá)，從而提高細(xì)胞抗氧化損傷能力，為細(xì)胞提供深層次

3、、長(zhǎng)久地保護(hù)作用。有研究表明，激活Nrf2/ARE信號(hào)通路可以有效的預(yù)防或改善氧化因素導(dǎo)致的多種血管疾病。發(fā)現(xiàn)Nrf2激動(dòng)劑，通過啟動(dòng)Nrf2/ARE信號(hào)通路以提高血管內(nèi)皮細(xì)胞的抗氧化損傷能力，預(yù)防氧化應(yīng)激引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷或功能異常，有望成為防治心腦血管疾病的有效方法。
　　高圣草素是課題組從槲寄生中分離得到的一種二氫黃酮類化合物。高圣草素是一種抗氧化劑，具有體外自由基清除活性。本論文研究了高圣草素對(duì)過氧化氫(H2O2)引起的人

4、臍靜脈內(nèi)皮EA.hy926細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及對(duì)Nrf2信號(hào)通路的激動(dòng)作用。
　　MTT和細(xì)胞實(shí)時(shí)生長(zhǎng)檢測(cè)(RTCA)結(jié)果表明，高圣草素對(duì)H2O2引起的EA.hy926細(xì)胞增殖抑制表現(xiàn)出劑量依賴性保護(hù)作用。DAPI染色和AnnexinⅤ/PI雙染結(jié)果表明，高圣草素可以抵抗H2O2引起的EA.hy926細(xì)胞凋亡。免疫熒光、Western blot、real time RT-PCR、蛋白半衰期檢測(cè)等結(jié)果表明，高圣草素能夠誘導(dǎo)Nrf

5、2進(jìn)入細(xì)胞核、誘導(dǎo)Nrf2、NQO1和γGCS蛋白水平和mRNA水平提高、延長(zhǎng)Nrf2蛋白的半衰期。進(jìn)一步研究表明，高圣草素能夠增加細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽的含量、降低H2O2導(dǎo)致的胞內(nèi)ROS聚集、調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。通過Nrf2小分子干擾RNA(Nrf2-siRNA)沉默EA.hy926細(xì)胞中Nrf2基因表達(dá)，MTT、RTCA、Western blot等方法檢測(cè)，結(jié)果表明高圣草素保護(hù)作用消失，提示高圣草素的抗氧化損傷作用是通過調(diào)節(jié)

6、Nrf2信號(hào)通路。綜上所述，高圣草素是一種天然的Nrf2激動(dòng)劑，可以通過激活Nrf2/ARE信號(hào)通路保護(hù)EA.hy926細(xì)胞抵制H2O2引起的線粒體介導(dǎo)的凋亡。
　　惡性腫瘤成為當(dāng)今世界威脅人類健康、導(dǎo)致死亡的首要原因之一。其中肺癌因發(fā)病率和死亡率高而備受關(guān)注。隨著全球肺癌的發(fā)病率和死亡率地逐年增加，急需開發(fā)有效的化療藥物來延長(zhǎng)肺癌患者的生命周期。
　　澤瀉醇B-23-乙酸酯是課題組從建澤瀉中分離得到的四環(huán)三萜類化合物。采用

7、MTT法檢測(cè)了四個(gè)結(jié)構(gòu)類似的四環(huán)三萜化合物，澤瀉醇A(A1)、澤瀉醇A-23-乙酸酯(A2)、澤瀉醇O(A3)和澤瀉醇B-23-乙酸酯(A4)對(duì)兩種肺癌細(xì)胞增殖活性的影響。結(jié)果表明澤瀉醇A(A1)和澤瀉醇B-23-乙酸酯(A4)對(duì)A549和NCI-H292兩種肺癌細(xì)胞株表現(xiàn)出較明顯的增殖抑制活性。選擇了獲得量大、活性更好的澤瀉醇B-23-乙酸酯為目標(biāo)化合物，開展了進(jìn)一步研究。DAPI染色和AnnexinⅤ/PI雙染結(jié)果表明A4能夠誘導(dǎo)肺

8、癌細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，化合物A4可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS聚集、降低線粒體膜電位。此外，A4能夠誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞S期阻滯，而對(duì)A549細(xì)胞周期無明顯影響。采用Western b lot、免疫熒光等方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，A4能夠促進(jìn)促凋亡蛋白Bax表達(dá)、抑制抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL表達(dá)、促使細(xì)胞色素c從線粒體釋放，進(jìn)而激活caspase-9、caspase-3和PARP等的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致肺癌細(xì)胞的凋亡。A4還可促使凋亡誘導(dǎo)因子