利用膠原—透明質(zhì)酸—硫酸軟骨素三元納米支架修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的實驗研究.pdf

1、目的:評估自主研發(fā)的組織工程軟骨納米支架的相關(guān)參數(shù)及其對兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)效果。方法:(1)以膠原(Collagen，Col)、透明質(zhì)酸(Hyaluronicacid，HA)、硫酸軟骨素(Chondroitin sulfate，CS)為原料，按一定比例溶于三氟乙醇和水的混合溶劑中制成溶液，通過靜電紡絲技術(shù)制備組織工程軟骨三維納米多孔支架材料;通過掃描電鏡觀察其表面形貌，并檢測支架的吸水率、接觸角、降解率、粘附率及增殖率。選擇形貌優(yōu)良、

2、理化性質(zhì)及生物學(xué)性能較好的納米支架做進(jìn)一步的體內(nèi)外實驗;(2)取1周齡新西蘭大白兔肋軟骨，酶消化后體外培養(yǎng)擴增，得到軟骨細(xì)胞，選擇P2代軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞。將軟骨細(xì)胞按一定比例接種于支架后，分別培養(yǎng)7天、14天，常規(guī)石蠟包埋切片，經(jīng)蘇木素-伊紅(Hematoxylin-eosin staining，HE)染色、番紅-O染色(Safranin-O)及蛋白聚糖(Aggrecan)免疫熒光染色、Ⅱ型膠原(CollagenⅡ)免疫組織化學(xué)染色

3、觀察細(xì)胞在支架上的生長及細(xì)胞外基質(zhì)分泌情況;(3)制作兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型并分為3組，實驗組植入細(xì)胞支架復(fù)合物，對照組植入單純的組織工程軟骨納米支架材料，空白組不做任何處理。術(shù)后分別于8、12周取材，通過大體觀察、HE染色、Safranin-O及CollagenⅡ免疫組化染色等方法觀察缺損關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)情況。結(jié)果:(1)以軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分COL、HA、CS為原料，利用靜電紡絲技術(shù)成功制備出組織工程軟骨納米支架材料。通過對納米材料

4、纖維直徑、接觸角、降解率、吸水率檢測結(jié)果表明靜電紡絲的主要參數(shù)為:環(huán)境溫度25℃-30℃;靜電紡絲電壓15kv-22kv;靜電紡絲針頭型號為6號;針頭與接收裝置的距離為10cm-12cm;注射器經(jīng)注射泵送液速度9ml/h-11ml/h，紡絲的最佳濃度范圍為80-120mg/ml，三種原料支架的最佳比例為6-8∶1∶1-2。該條件下制備的復(fù)合三元納米纖維支架的直徑主要分布在126.5±23.3nm-374.7nm±14.1nm之間，支架具

5、有良好的親水性、降解性能較好，軟骨細(xì)胞在支架上粘附和增殖情況良好。(2)軟骨細(xì)胞在支架上培養(yǎng)后包埋切片染色的結(jié)果表明，軟骨細(xì)胞在支架上均勻生長;番紅-O染色及蛋白聚糖免疫熒光染色、Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色均為陽性，表明軟骨細(xì)胞在支架上能較長時間存活并分泌糖胺聚糖、ColⅡ和Aggrecan等軟骨細(xì)胞外基質(zhì)細(xì)胞。(3)兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)實驗結(jié)果表明，術(shù)后8周，實驗組缺損軟骨即可見明顯修復(fù);術(shù)后12周，大體觀察可見實驗組關(guān)節(jié)軟骨缺損處修復(fù)

6、良好，組織化學(xué)染色結(jié)果表明新生組織與正常軟骨組織邊緣模糊，與軟骨下骨連接緊密，新生組織以透明軟骨細(xì)胞為主，軟骨陷窩排列有序，與正常軟骨陷窩相似。對照組的缺損的關(guān)節(jié)軟骨也得到了部分修復(fù)。而空白組缺損軟骨的自我修復(fù)情況較差，術(shù)后12周，缺損仍舊明顯，且染色結(jié)果顯示缺損處的新生組織以纖維組織為主。結(jié)論:(1)采用靜電紡絲技術(shù)，以軟骨細(xì)胞外基質(zhì)主要成分COL、HA、CS為原料，通過調(diào)節(jié)靜電紡絲相關(guān)參數(shù)，可以獲得理化特性和生物學(xué)性能良好的組織工程