人工栽培蛹蟲草（Cordyceps militaris）性狀變異的遺傳學(xué)分析.pdf

1、蛹蟲草Cordyceps militaris(L.)Link為蟲草屬食、藥用真菌,它可以代替冬蟲夏草入藥.而在人工馴化栽培過程中,蛹蟲草菌種的退化現(xiàn)象比較嚴(yán)重,目前對蟲草屬真菌的研究只限于菌種的鑒定、營養(yǎng)成分分析、藥用價值研究及人工栽培等.用常規(guī)選育方法雖然能減少一定的損失,但不能從根本上解決菌種退化這一長期困擾企業(yè)生產(chǎn)的問題.針對菌種退化問題,主要是利用有性循環(huán)、原生質(zhì)體融合和遺傳工程等途徑進(jìn)行菌株改良,應(yīng)用分子生物學(xué)手段只是研究種內(nèi)

2、、種間的系統(tǒng)關(guān)系等,而關(guān)于菌種退化遺傳機理的研究尚未見報道.菌種退化是菌類栽培過程中普遍存在的,也是生產(chǎn)當(dāng)中迫切希望得到解決的問題.本實驗中,運用RFLP和RAPD兩種分子標(biāo)記技術(shù)及同工酶分析技術(shù)對正常菌株和其退化菌株進(jìn)行了DNA和蛋白質(zhì)水平的分析,以期獲得表型性狀的變化所涉及的DNA和蛋白質(zhì)水平的標(biāo)記.PCR-RFLP實驗,采用真菌通用引物ITS1和ITS4,擴增出5.8S和其兩端的兩個轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS),選用5種識別四個堿基的內(nèi)切

3、酶(HaeⅢ、AfaⅠ、Tag Ⅰ、Alu Ⅰ和Xsp Ⅰ)進(jìn)行酶切,其中只有Xsp Ⅰ酶切結(jié)果在兩個菌種中存在差異,進(jìn)一步測序表明,整個片段全長534bp,共有13個位點發(fā)生堿基突變,且都為c轉(zhuǎn)換為t.野生馴化菌株的測序結(jié)果與Genbank中檢索到的序列順序一致.RAPD實驗,選用Operon公司的4組(G組、H組、L組、M組)計80個隨機引物進(jìn)行PCR擴增,共篩選出9個對所有供試個體均存在明顯差異的引物.由這9種引物計算所得的菌株間

4、的相似系數(shù)為:OPG9:28.6％;OPH4:44.4％;OPH12:33.3％;OPL1:50％;OPL9:40％;OPM2:33.3％;OPM17:57.1％:OPM19:72.7％;OPG13為0,其中最大值為72.7％,平均值為39.9％,結(jié)果表明了退化菌株較野生馴化菌株在DNA水平上發(fā)生了頻率較高的突變,這些突變可能與菌種退化的基因相關(guān)聯(lián).采用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)對菌絲體階段的蛹蟲草Cordyceps militaris(L

5、.)Link及其退化菌株進(jìn)行了同工酶分析.共檢測了酯酶(EST)、過氧化物酶(PER)、超氧化物歧化酶(SOD)、蘋果酸酶(ME)、蘋果酸脫氫酶(MDH)、谷氨酸脫氫酶(GDH)、乙醇脫氫酶(ADH)、細(xì)胞色素氧化酶共計8種同工酶,其中酯酶、超氧化物歧化酶、蘋果酸酶、蘋果酸脫氫酶在正常菌株和退化菌株中出現(xiàn)了明顯的差異.而其余四種酶在正常菌株和退化菌株中酶譜一致.本研究不僅可以作為菌株退化早期鑒別的手段之一,而且為進(jìn)一步研究菌種退化遺傳機