大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化比較的體外研究.pdf

1、第一章大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的提取與培養(yǎng) 目的：分離大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，比較兩種細(xì)胞的特征，為脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞可替代骨髓基質(zhì)細(xì)胞做為種子細(xì)胞提供依據(jù)。 方法：利用細(xì)胞貼壁性對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行分離，比較兩種細(xì)胞的情況，包括(1)單位質(zhì)量組織獲得兩種細(xì)胞的量、(2)細(xì)胞形態(tài)、(3)細(xì)胞貼壁率、(4)細(xì)胞動力學(xué)、(5)細(xì)胞表面標(biāo)記。并對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。 結(jié)果：(1

2、)單位質(zhì)量組織獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量為(2.23±0.35)×10<'5>／g，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞為(2.66±0.75)×10<'5>／g，采用成組設(shè)計兩樣本比較的t檢驗，t=-1.446，P=0.179>0.05，尚不能認(rèn)為兩者有差異，可以認(rèn)為在單位質(zhì)量骨髓和脂肪組織中獲得的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量相當(dāng)。(2)兩種細(xì)胞形態(tài)均為條索樣，呈成纖維細(xì)胞形態(tài)。(3)應(yīng)用直線相關(guān)分析考察兩組細(xì)胞的貼壁率之間的關(guān)系，相關(guān)系數(shù)，r=

3、0.999，決定系數(shù)r<'2>=0.997，可以認(rèn)為兩貼壁率之間有直線相關(guān)關(guān)系，可以認(rèn)為在不同的時間點兩種細(xì)胞的貼壁率相似，并且有共同遞增趨勢。(4)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相當(dāng)，消化后的第2、5代細(xì)胞經(jīng)歷24～48小時的潛伏期后，進(jìn)入6～9天的對數(shù)生長期，然后過渡到平臺期。(5)通過流式實驗和免疫細(xì)胞化學(xué)顯示，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面表達(dá)CD29、CD44，不表達(dá)CD34。 結(jié)論：(1)自大鼠

4、脂肪中可提取出與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞類似的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。(2)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)記與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞類似。 第二章 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)的比較 目的:對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨能力進(jìn)行比較,為脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞替代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成為骨組織工程的種子細(xì)胞提供依據(jù)。 方法:應(yīng)用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞誘導(dǎo)后的變化;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)后用鈣鈷法染色、四環(huán)素

5、熒光標(biāo)記、I型膠原染色、茜素紅染色、堿性磷酸酶測定、RT-PCR檢測骨鈣素mRNA表達(dá)等方法,脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)前后透射電鏡觀察細(xì)胞變化,對間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成骨的機制進(jìn)行探討。 結(jié)果:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)后細(xì)胞逐漸出現(xiàn)突起,胞漿內(nèi)出現(xiàn)分泌性顆粒。兩種細(xì)胞誘導(dǎo)3周后,茜素紅染色出現(xiàn)淡紅色鈣結(jié)節(jié);四環(huán)素?zé)晒馊旧霈F(xiàn)明亮黃色熒光鈣結(jié)節(jié)。改良鈣鈷法染色,細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)黑色顆粒。兩種細(xì)胞誘導(dǎo)后堿性磷酸酶(ALP)定量檢

6、測,對于兩組不同來源細(xì)胞誘導(dǎo)后的ALP值進(jìn)行等級相關(guān)分析,Spearman相關(guān)系數(shù)γ<,s>=0.946,P<0.001,可以認(rèn)為兩組之間有直線相關(guān)關(guān)系,ALP值隨時間的增加而共同遞增。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)2周后,通過投射電鏡觀察,對其進(jìn)行誘導(dǎo)前后比較,誘導(dǎo)后的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞明顯增大,表面的絨毛突起減少,胞核不明顯,胞漿中的細(xì)胞器發(fā)達(dá),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張明顯。通過RT-PCR檢測兩種細(xì)胞誘導(dǎo)2周后的骨鈣素(BGP)mRNA表達(dá),兩組BGP的m

7、RNA表達(dá)比較無顯著性差異。 結(jié)論:(1)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可向成骨方向誘導(dǎo)分化。(2)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨誘導(dǎo)后，可表達(dá)I型膠原、ALP、BGP，并出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié)。(3)AMSCs經(jīng)過誘導(dǎo)后，可向成骨細(xì)胞方向分化。(4)AMSCs與bMSCs成骨能力無顯著性差異。(5)AMSCs可替代bMSCs做為骨組織工程的種子細(xì)胞。 第三章 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞接種載體成骨分化的研究 目的：脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞可與羥基磷灰石復(fù)

8、合向成骨細(xì)胞分化，檢測兩種羥基磷灰石復(fù)合細(xì)胞成骨能力的差別。 方法：通過掃描電鏡觀察脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞與普通羥基磷灰石和納米級羥基磷灰石復(fù)合情況。檢測細(xì)胞與載體復(fù)合后，表達(dá)堿性磷酸酶和骨鈣素的情況。 結(jié)果：在將AMSCs細(xì)胞種植于兩種HA載體表面，向成骨方向誘導(dǎo)4周后，通過掃描電鏡觀察，HA載體表面有細(xì)胞存在。普通羥基磷灰石組ALP值為9.782±2.085金氏U/100ml，納米級羥基磷灰石組ALP值為11.771±3.

9、091金氏U/100ml，并且在兩種不同的羥基磷灰石(HA)的表達(dá)有顯著性差異(P=0.041<0.05)。BGP的檢測發(fā)現(xiàn)，在AMSCs細(xì)胞種植誘導(dǎo)2周后，在兩種載體上均有BGP的表達(dá)，并且在納米級羥基磷灰石上的表達(dá)要高于普通級羥基磷灰石。 結(jié)論：(1)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(AMSCs)可在載體上復(fù)合生長。(2)AMSCs與HA載體復(fù)合后，可表達(dá)成骨細(xì)胞的特征。(3)誘導(dǎo)成骨后，在納米級羥基磷灰石上復(fù)合表達(dá)堿性磷酸酶的量高于普通級