人巨細(xì)胞病毒UL149基因編碼能力及編碼產(chǎn)物結(jié)合多肽的氨基酸序列分析.pdf

1、人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)是皰疹病毒科的一種，人群普遍感染，絕大多數(shù)表現(xiàn)為無癥狀。然而，對于免疫缺陷病人，如艾滋病患者或器官移植患者，HCMV感染可以是致死性的;同時(shí)對于先天感染者，HCMV感染可以導(dǎo)致新生兒各種先天畸形和疾病，如巨結(jié)腸，肝炎綜合征，小頭畸形等等。HCMV的致病機(jī)理至今仍不明了。然而，HCMV在免疫系統(tǒng)功能缺陷和不完善的人群中的這種致病作用，提示HCMV的致病機(jī)制與免疫系統(tǒng)功能關(guān)

2、系密切:一方面與宿主的免疫系統(tǒng)功能有關(guān)，另一方面與病毒的自身基因結(jié)構(gòu)及與此相關(guān)的病毒復(fù)制能力、組織嗜性及病毒逃避機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)的能力等有關(guān)。
　　 事實(shí)上，Toledo等臨床分離株在病毒毒力和致病性方面明顯比AD169、Towne等實(shí)驗(yàn)室株增強(qiáng)，小鼠動物模型研究[1]發(fā)現(xiàn)Toledo株比實(shí)驗(yàn)株AD169株復(fù)制水平至少高三倍。1996年，Cha等人從基因水平對臨床低傳代分離株與實(shí)驗(yàn)室株進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)Toledo株比AD169株

3、多了19個(gè)ORF（約15kb），依次命名為UL133～UL151，即UL/b'區(qū)，并由此推斷，此UL/b'區(qū)與HCMV的致病性密切相關(guān)。隨后的研究表明有關(guān)HCMV臨床低傳代分離株UL/b'區(qū)基因不僅高度多變，而且部分基因的多態(tài)序列存在著不同的基因型，如UL144，UL146，UL147等。除此之外，我們在對UL/b'區(qū)基因多態(tài)性的系列研究中，還發(fā)現(xiàn)UL139，UL149基因存在高度多態(tài)及基因分型。
　　 然而，與HCMV致病性密

4、切相關(guān)的UL/b'區(qū)基因功能的研究還比較少。UL141的編碼產(chǎn)物可以通過與CD155結(jié)合來干擾NK細(xì)胞功能，進(jìn)而來抑制其殺傷感染細(xì)胞的作用;UL142可以編碼一種MHC-I類分子樣物質(zhì)，可以下調(diào)NKG2D的天然配體MICA，并且以一種克隆依賴的方式抑制NK細(xì)胞對感染細(xì)胞的溶解作用;UL144可以通過不同的方式干擾機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng):可以和B、T淋巴細(xì)胞衰減子BTLA結(jié)合，選擇性模擬皰疹病毒入侵介質(zhì)HVEM的抑制性共同信號功能，從而抑制T細(xì)

5、胞的增殖;還可以通過TRAF6依賴的方式激活NF-κB，進(jìn)而激活趨化因子CCL22的表達(dá)，最終導(dǎo)致HCMV逃避免疫監(jiān)視作用。
　　 人巨細(xì)胞病毒作為一種原核生物，其基因轉(zhuǎn)錄時(shí)表現(xiàn)的多順反子特點(diǎn)，使HCMV的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)更加多樣化。研究人員對UL/b'區(qū)的基因多態(tài)性研究中更多地應(yīng)用生物軟件對基因的編碼能力和功能進(jìn)行了預(yù)測，但是與現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果比較并不完全一致。這表明，病毒的蛋白產(chǎn)物在發(fā)揮其生物學(xué)方面是比較復(fù)雜的，僅通過病毒基因

6、的核酸序列來推測其生物學(xué)功能也是不完全的，還應(yīng)在實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上來明確各病毒基因編碼產(chǎn)物的生物學(xué)功能。
　　 目前，還沒有關(guān)于HCMV UL149基因編碼產(chǎn)物生物學(xué)功能方面的研究報(bào)道。本文主要研究UL149基因的編碼能力及與其蛋白質(zhì)的結(jié)合配體的能力，初步探討UL149基因在HCMV致病中的作用機(jī)制。
　　 材料與方法：
　　 一、標(biāo)本來源
　　 HCMV低傳代臨床分離株3株來自我院1988-1993年間住院患

7、兒，4株來源于我院2006-2007年住院確診為HCMV感染相關(guān)疾病患兒。分離株-70℃凍存。
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法
　　 （一）標(biāo)本處理
　　 1、提取RNA標(biāo)本取自病毒分離實(shí)驗(yàn)，將HCMV病毒感染的人胚肺細(xì)胞溶解在Trizol試劑中，采用氯仿/異戊醇法抽提。
　　 2、提取DNA標(biāo)本取自病毒分離實(shí)驗(yàn)，取分離株上清與等體積裂解液混合，煮沸15分鐘，離心數(shù)秒。
　　 （二）RACE法擴(kuò)增UL149基

8、因mRNA
　　 1、根據(jù)Toledo株序列，應(yīng)用軟件Primer premier5.0設(shè)計(jì)UL149基因特異性RACE擴(kuò)增引物。
　　 2、應(yīng)用Takara3'-Full RACE Core Set Ver2.0 Kit及5'-Full RACE Kit，按說明進(jìn)行操作。瓊脂糖電泳檢測、PCR純化、T-A克隆測序
　　 3、序列結(jié)果分析序列分析軟件DNAClub，Bioedit，DNAStar等。
　　

9、 （三）隨機(jī)多肽文庫篩選與不同基因型UL149蛋白具有結(jié)合能力的多肽氨基酸
　　 1、不同基因型UL149-GST融合蛋白的克隆
　　 2、融合蛋白的表達(dá)融合蛋白UL149-GST的純化
　　 3、隨機(jī)多肽文庫篩選4、多肽克隆質(zhì)粒中插入序列的測序及隨機(jī)多肽區(qū)域氨基酸序列分析
　　 5、應(yīng)用Clustral X軟件進(jìn)行篩選多肽的氨基酸序列同源性比較
　　 6、已知蛋白數(shù)據(jù)庫的氨基酸序列比較
　

10、　 結(jié)果：
　　 一、HCMV UL149基因編碼能力結(jié)果
　　 1、4例HCMV低傳代分離株中UL149基因3'RACE-RT-PCR檢測結(jié)果均為陽性，且含有2個(gè)片段，一個(gè)片斷長約為500bp左右，另一個(gè)片斷長約1000-1200bp;
　　 2、4個(gè)標(biāo)本的3'RACE擴(kuò)增結(jié)果序列分析表明UL149基因均有不同長度的轉(zhuǎn)錄，隨后連接來源于UL150基因區(qū)域的反向互補(bǔ)序列，來源于UL140、US7基因區(qū)域的反向互

11、補(bǔ)序列，以及來源于人基因組的Homo sapiens adaptor-relatedprotein copmplex2，mul，subunit序列;序列結(jié)尾附帶相近的分支信號TTAAT、TAA、TAAAAATAAA、TAAA等，以及polyA結(jié)構(gòu);剪接信號多數(shù)符合GT/AG原則，但是還有不典型的信號AG/CC、CG/CA、CA/GG、AT/GG，以及重復(fù)序列CGGCTACAGC、TGCGGGA、GCTCC等。
　　 3、2例標(biāo)本

12、5'RACE-RT-PCR結(jié)果陽性。
　　 二、HCMV UL149蛋白結(jié)合多肽氨基酸同源性分析
　　 多肽文庫篩選實(shí)驗(yàn)共得到UL149Ⅰ型蛋白的結(jié)合多肽序列17個(gè)，Ⅱ型蛋白的結(jié)合序列14個(gè)，Ⅲ型蛋白的結(jié)合序列36個(gè)，由三種基因型蛋白的篩選序列之間結(jié)構(gòu)同源性較高，存在結(jié)構(gòu)相似的區(qū)域，即W/A/F/V-D/E-D/E-G-W/F/I/L。
　　 三、HCMV UL149蛋白結(jié)合多肽氨基酸與已知蛋白數(shù)據(jù)庫比較

13、　　 結(jié)果：
　　 1、人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)
　　 在三種基因型的UL149蛋白篩選出的67個(gè)結(jié)合多肽的氨基酸序列中，共有39個(gè)序列顯示與人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)同源，并且占據(jù)抗原結(jié)合位點(diǎn)或異源二聚體結(jié)合位點(diǎn)，占58.2％:其中在Ⅰ型蛋白的結(jié)合多肽中有13個(gè)序列，占76.5％(13/17)，在Ⅱ型蛋白的結(jié)合多肽中有8個(gè)序列，占57.1％(8/14)，在Ⅲ型蛋白的結(jié)合多肽中有18個(gè)序列，占50.0％(18/36)，說明三

14、種基因型UL149蛋白的結(jié)合多肽均與與免疫球蛋白重鏈可變區(qū)具有密切關(guān)系。
　　 2、其他
　　 具有較多同源性的結(jié)合多肽序列還有鋅指蛋白、SH3結(jié)構(gòu)域、補(bǔ)體因子H、絲氨酸/色氨酸蛋白激酶、WD結(jié)構(gòu)域、核因子、MHC-I類分子等
　　 結(jié)論：
　　 1、HCMV UL149基因在臨床低傳代分離株中具有表達(dá)活性，存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄子。
　　 2、HCMVUL149基因區(qū)域可能存在可變剪接。
　　 3

15、、HCMV UL149三個(gè)基因型編碼的蛋白質(zhì)結(jié)合多肽氨基酸具有較高的同源性，存在結(jié)構(gòu)相似的區(qū)域，即W/A/F/V-D/E-D/E-G-W/F/I/L。
　　 4、HCMV UL149蛋白結(jié)合多肽與人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)、絲氨酸/色氨酸蛋白激酶、補(bǔ)體因子H、MHC-(I)類分子等具有較高的同源序列，提示UL149蛋白可能參與免疫逃避作用;UL149與SH3結(jié)構(gòu)域、鋅脂蛋白、WD結(jié)構(gòu)域具有同源序列，提示UL149蛋白還可能參與基因的