人胚胎干細胞傳代培養(yǎng)和神經誘導分化過程中基因組遺傳變異的動態(tài)變化.pdf

1、人胚胎干細胞(Human Embryonic Stem Cells，hESCs)通常來源于胚胎發(fā)育過程中囊胚的內細胞團(InnerCellMass，ICM)，具有發(fā)育全能性的特點，被認為是再生醫(yī)學最重要的種子細胞之一。以干細胞為核心的再生醫(yī)學越來越受到科學家及臨床工作者的關注。
　　 hESCs通過移植、分化與組織再生促進機體創(chuàng)傷修復，治療疾病。盡管hESCs發(fā)展前景很好，但是仍存在安全風險。目前尚未明確hESCs在長期傳代培養(yǎng)

2、和誘導分化過程中基因組是否存在動態(tài)變異以及遺傳特征是否穩(wěn)定。因此，要把hESCs應用于臨床治療首先要明確hESCs是否安全可靠。深入探索hESCs種子細胞的遺傳穩(wěn)定性及相關分子機制，對于hESCs的科學研究和臨床應用具有重要意義。但是目前國內外尚缺乏從建系、長期傳代培養(yǎng)以及誘導分化過程中對遺傳變異的系統(tǒng)研究。
　　 本研究認為在建系早期就要明確hESCs的遺傳特征，伴隨傳代培養(yǎng)，遺傳變異是否會增加，在后續(xù)的誘導分化過程中遺傳變異

3、的變化是否會繼續(xù)存在，這是hESCs臨床應用的瓶頸。因此利用輔助生殖技術中人的廢棄胚胎建立hESCs，在傳統(tǒng)G顯帶鑒定核型的基礎上，進一步應用單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)芯片對hESCs基因組DNA進行分子細胞遺傳學檢測，明確建系早期hESCs的遺傳變異特征;繼而應用SNP芯片監(jiān)測人胚胎干細胞長期傳代培養(yǎng)過程中基因組遺傳變異的動態(tài)變化和甲基化芯片檢測基因組的甲基化狀態(tài)，對每株hE

4、SC系都進行了SNP、拷貝數變異（Copy Number Variants，CNV）、雜合性缺失(Loss Of Heterozygosity,LOH)和甲基化的檢測，全面評價了hESCs基因組的分子遺傳學變化;利用擬胚體途徑將hESCs誘導分化為神經前體細胞，提取基因組DNA應用SNP芯片檢測不同傳代數的克隆誘導而來的神經前體細胞基因組變異特征，研究誘導分化過程對基因組遺傳變異的影響，為今后細胞移植的安全性提供理論依據和實踐基礎。

5、r>　　 本研究的主要創(chuàng)新點:①用異常原核受精卵和劣質胚胎建立正常核型的hESC系，并用SNP芯片對hESC系進行分子細胞遺傳學鑒定。②研究混合飼養(yǎng)層長期傳代培養(yǎng)過程中hESC基因組SNP、CNV、LOH和甲基化的變化。③研究hESC系向神經細胞誘導分化過程中，神經前體細胞基因組的SNP、CNV、LOH的變化。經查新未見相同研究。
　　 第一部分：人廢棄胚胎來源的胚胎干細胞系的建立及遺傳變異的鑒定
　　 目的:

6、　　 建立hESC系并進行全面鑒定。建立hESC系的SNP芯片檢查方法，分析hESC系的基因遺傳特征，建立hESC系與已知疾病相關的基因組CNV遺傳信息檔案。
　　 方法:
　　 1.收集鄭州大學第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學中心體外受精-胚胎移植（In Vitro Fertilization Embryo Transfer,IVF-ET）或卵胞漿內單精子注射-胚胎移植（Introcy to Plasm Sperm Inject

7、ion Embryo Transfer,ICSI-ET）患者的新鮮廢棄胚胎，序貫培養(yǎng)到囊胚階段?；颊吆炇鹬橥鈺?br>　　 2.采用機械法分離囊胚內細胞團，將其種植于小鼠胚胎成纖維細胞和人包皮成纖維細胞按1∶1混合的飼養(yǎng)層上，機械傳代法傳代純化，建立hESC系。
　　 3.對hESC系進行全能性鑒定，用免疫熒光檢測表面抗原SSEA-1、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81的表達;RT-PCR法檢測OCT4(P

8、OU5F1)、SOX2和NANOG基因mRNA的表達。
　　 4.傳統(tǒng)G顯帶進行核型分析，同時應用高分辨率Infinium High-Density Human Cyto SNP-12DNA芯片檢測hESC基因組DNA的CNV和LOH，分析hESCs和疾病相關的分子遺傳學背景。
　　 結果:
　　 1.432名IVF/ICSI周期患者的772枚新鮮廢棄胚胎，經序貫培養(yǎng)形成117個囊胚，囊胚形成率15.2％，優(yōu)質囊

9、胚58枚，優(yōu)質囊胚率7.5％。分離擴增117枚ICM，共建立6個hESCs細胞系:0PN來源1個系，2PNⅣ級胚胎來源1個系，1PN來源2個系，3PN來源2個系。
　　 2.6個hESCs細胞系表面抗原SSEA-1呈陰性表達，SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81呈陽性表達，PCR檢測OCT4(POU5F1)、SOX2和NANOG基因的mRNA均有表達。
　　 3.6個hESCs體外可以分化為擬胚體，并且表達三

10、胚層標記物神經巢蛋白、心肌肌鈣蛋白和甲胎蛋白;體內可以分化為畸胎瘤。
　　 4.NO19P25(3PN)、NO20P24(3PN)和NO21P17(2PN(Ⅳ))G顯帶核型分析結果均為46，XY。
　　 5.NO19P25和NO20P24分別有7個缺失，NO21P17有2個擴增、5個缺失。NO20P24的11p11.2-11p11.12上存在2.98Mb的缺失。
　　 6.NO20P24的Xq28有一個長度為2.

11、2Mb的LOH，涉及相關基因84個;NO21P17的11p11.2-11p11.12有一個長度為3.6Mb的LOH，涉及相關基因16個。
　　 結論:
　　 1.異常原核受精卵可以發(fā)育成優(yōu)質囊胚，建立正常核型的hESC系。
　　 2.用SNP芯片分析hESC系的分子細胞遺傳學特征，可以為其提供與已知疾病相關的“身份鑒定”。
　　 第二部分：人胚胎干細胞長期傳代培養(yǎng)過程中基因組遺傳變異和甲基化的動態(tài)變化

12、r>　　 目的:
　　 對建立的hESC系進行長期傳代培養(yǎng)，探討在培養(yǎng)過程中hESCs的SNP、CNV、LOH和甲基化的動態(tài)變化。
　　 方法:
　　 1.玻璃化冷凍復蘇Zh1-P16和Zh21-P17，在混合飼養(yǎng)層MMC上長期傳代培養(yǎng)，每5～7天用機械法傳代。
　　 2.分別提取Zh1系P20/P27和Zh21系P27/P60/P68代的基因組DNA，行高分辨率的114萬SNPs位點Illumina

13、Human omni1-quad beadchip基因分型芯片檢測，分析SNP、CNV、LOH的變化。
　　 3.利用上述樣品DNA進行Infinium Human Methylation 27 Bead Chip甲基化芯片檢測，分析甲基化的變化。
　　 4.通過KEGG代謝通路數據庫(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)分析CNV和甲基化的相關基因通路及基因的功能。
　　

14、 結果:
　　 1.Zh1-P20、Zh1-P27G-顯帶核型分析為46，XX，F(xiàn)ISH分析為二倍體46，XX;Zh21-P27、Zh21-P60和Zh21-P68G-顯帶核型分析為46，XY，F(xiàn)ISH分析為二倍體46，XY。
　　 2.早期傳代數Zh1P20-＞27的SNP變異率為4.01×10-6，早晚期傳代數Zh21P27-＞60的SNP變異率為1.46×10-5，后者高于前者。
　　 3.Zh21-P2

15、7全基因組CNV的缺失比例為99.38％，擴增比例為0.62％;Zh1-P20缺失比例為96.77％，擴增比例為3.23％;與千人基因組計劃中國北京漢族人（TheHanPeopleInBeijingOfChina，CHB）(91.20％，8.80％)相比無統(tǒng)計學差異。
　　 4.在Zh21-P60/27中篩選出＞0.5kb的5個CNV，在Zh21-P68/60晚期代數，共有10個＞IMB的CNVs。CNV相關基因通路分析:涉及到

16、三個基因的代謝通路，GABRG1、NEGR1和FOLZH1。
　　 5.hESCs長期培養(yǎng)中，Zh21的P27/60有25個大于1Mb的LOH變異，同一個系的P60/68有13個LOH變異。在Zh1-P20/27，3q26.1有一個1.48Mb的LOH。
　　 6.hESCs長期培養(yǎng)過程中甲基化的分析，晚期代數Zh21P68相對于早期代數Zh21P27，高甲基化位點有196個，低甲基化的位點有91個。
　　 7.

17、甲基化顯著性差異基因分析:晚期代數Zh21P68與早期代數Zh21P27比較共有10個顯著性差異基因，主要和絲裂原激活的蛋白激酶信號通路相關。
　　 結論:
　　 1.長期傳代培養(yǎng)過程中hESCs存在SNP、CNV和LOH的動態(tài)變化，在早期傳代過程中hESCs能夠保持基因組穩(wěn)定性，隨著傳代次數的增加，基因組的不穩(wěn)定性也逐漸增強。
　　 2.臨床應用之前，核型穩(wěn)定的hESCs在傳代過程中也應該間隔合適的傳代代數用高

18、分辨率的方法監(jiān)測基因組的染色體特征。
　　 3.hESCs長期培養(yǎng)過程中晚期代數的細胞中高甲基化位點增多。
　　 4.分析遺傳變異相關基因的通路，有助于理解變異基因的生物學功能。
　　 第三部分：不同傳代數的人胚胎干細胞神經誘導分化的遺傳變異研究
　　 目的:
　　 探討體外神經誘導分化過程對基因組變異CNV的影響，為今后細胞移植的安全性提供實驗數據和理論基礎。
　　 方法:
　　

19、 1.體外通過擬胚體途徑將hESCs定向分化為神經球和神經前體細胞，光鏡觀察神經誘導分化細胞形態(tài)。
　　 2.免疫熒光檢測神經球標志物Nestin和神經前體細胞的特異性標志物Nestin和Map2。
　　 3.提取神經球的基因組DNA，通過Infinium High Density Human Cyto SNP-12DNA Bead Chip芯片檢測誘導分化后的神經前體細胞的遺傳變異（CNV和LOH）。
　　 結

20、果:
　　 1.光鏡下MMC飼養(yǎng)層上hESCs細胞呈克隆樣巢狀生長，經過EB培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)后，克隆團塊變?yōu)榍蛐螒腋≡谂囵B(yǎng)液中，經過神經誘導培養(yǎng)基和神經球培養(yǎng)基誘導后，形成神經球，貼壁分化的細胞逐漸向神經細胞樣改變形態(tài)，呈雙極或多極并有分枝樣突出或者突觸。
　　 2.分化后期貼壁分化的細胞Nestin和Map2免疫熒光染色陽性，呈現(xiàn)神經前體細胞特征。
　　 3.神經誘導分化前后，Zh1早期代數穩(wěn)定存在9p21.1的

21、雜合性缺失和10p12.31的單拷貝增加，誘導后神經球中CNV長度分別增加0.01和0.02Mb，涉及相同的基因。
　　 4.NO21P41神經球出現(xiàn)13q13.2-q13.3長度為0.63Mb的缺失，涉及到3個基因NBEA、MAB21L1和MIR548F5。NO21p71神經球出現(xiàn)20q11.21長度為0.75Mb的擴增，涉及到14個基因DEFB115-124、REM1、NCRNA00028、HM13、PSIMCT-1、ID1

22、、COX4I2、BCL2L1、TPX2、MYLK2、FOXS1、TTLL9、PDRG1和XKR7。
　　 5.Zh1系P37克隆、P27、P32、P33、P34、P38、P42、P44和P49神經球共9個樣品均有Xp11.21-p11.1上3.2Mb的LOH;Zh21系P17、P41克隆與P41、P71神經球共4個樣品均有11p11.2-p11.12上3.6Mb的LOH。
　　 結論:
　　 1.體外經EB途徑成

23、功將Zh1和Zh21hESCs定向分化為神經球和神經前體細胞。
　　 2.誘導分化過程中的CNV可以由hESCs繼承而來，雖然CNV相關基因不變，但長度會發(fā)生微小變化，早期代數會略有增加，而晚期代數呈現(xiàn)動態(tài)變化。
　　 3.神經誘導分化過程會產生新的CNV，晚期代數的細胞出現(xiàn)適應性生長。
　　 4.不僅需要嚴密監(jiān)測傳代培養(yǎng)的hESCs，也要監(jiān)測相應傳代數hESCs神經誘導分化的細胞，探索分化細胞的遺傳特征，確保移