腎康丸對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟NF-kB及MCP-1表達(dá)的影響.pdf

1、隨著人們生活習(xí)慣、飲食結(jié)構(gòu)的改變,糖尿病(Diabetes mellitus,DM)的發(fā)病率在全球迅速上升。糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)是DM患者最常見、最嚴(yán)重的全身性微血管并發(fā)癥之一。目前,DN的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,亦缺乏有效地治療手段。因此,有效地治療和預(yù)防DN成為臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中重要的問題。
　　 DN的發(fā)生一般認(rèn)為是多種原因綜合作用的結(jié)果,近年來研究揭示DN的發(fā)病在代謝紊亂與血流動(dòng)力學(xué)改變的基

2、礎(chǔ)上,炎癥機(jī)制是其持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵因素之一,其中炎癥性細(xì)胞因子核因子-κB(Nuclear factor-kappa.B,NF-κ B)及單核細(xì)胞趨化蛋白-1(Monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)起重要的介導(dǎo)作用。NF-κB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子,通常以無活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中,當(dāng)在DM狀態(tài)下受到感染、應(yīng)激、細(xì)胞因子、氧自由基、糖脂代謝紊亂、胰島素抵抗等因素刺激可致其活化,活化的NF-κB可

3、誘導(dǎo)許多因子的轉(zhuǎn)錄,包括細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor-a,TNF-a)；白介素系統(tǒng)；炎癥細(xì)胞趨化因子如MCP-1等。高表達(dá)的炎癥因子又進(jìn)一步刺激NF-κB活化,形成炎癥信號(hào)的正反饋,導(dǎo)致腎功能和組織學(xué)異常,促進(jìn)DN的進(jìn)展。受NF-κB調(diào)節(jié)的基因可參與腎臟病的進(jìn)展,其中,MCP-1作用最為重要,MCP-1是一種特異的炎癥細(xì)胞趨化因子,它能夠促使單核細(xì)胞由外周循環(huán)遷移到炎癥部位聚集并激活,通過多種機(jī)制損

4、傷腎臟組織,對(duì)DN的發(fā)生、發(fā)展起關(guān)鍵作用。因此,對(duì)DN時(shí)NF-κB和由其誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞趨化因子MCP-1表達(dá)的研究,必將有助于我們對(duì)DN發(fā)病機(jī)制的理解,為探索新的治療途徑和開發(fā)臨床新藥提供理論依據(jù)。
　　 目前西醫(yī)治療DN主要是控制高血糖、減少蛋白尿、控制高血壓、低蛋白飲食及糾正脂代謝紊亂、抗炎等對(duì)癥治療,至今尚沒有一個(gè)能完全阻斷DN進(jìn)展的藥物。因此,依據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)理論和發(fā)揮中醫(yī)藥治療DN的優(yōu)勢(shì)和特色,積極探求中醫(yī)藥治療DN的有效

5、方法,對(duì)防止或延緩其發(fā)展具有重要的意義。腎康丸作為醫(yī)院制劑,在臨床治療DN患者多年,療效確切,在一定程度上可延緩DN的進(jìn)展,但其治療DN的分子水平的機(jī)制尚不清楚。因此,本課題通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn),從NF-κB及MCP-1的表達(dá)出發(fā),探討腎康丸治療DN的分子基因水平的作用機(jī)制,為其臨床應(yīng)用提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。具體如下:
　　 第一部分腎康丸對(duì)DN大鼠的腎臟保護(hù)作用
　　 目的:探討腎康丸對(duì)DN大鼠模型的腎臟保護(hù)作用,為進(jìn)一步

6、研究藥物作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:首先用鏈脲佐菌素(Streptozotocill,STZ)按55mg·kg—1大鼠體重左下腹腔內(nèi)一次性注射制作DM大鼠模型。連續(xù)喂養(yǎng)2w(Week,w),測(cè)血糖、尿量、尿蛋白,若血糖值>16.6mmol·L-1、尿量>原尿量150％、尿蛋白排泄>30mg·kg·/24h以上,則造模成功。大鼠造模成功后,稱重,隨機(jī)分3組:模型對(duì)照組,美卡素組和腎康丸組,另設(shè)正常對(duì)照組。腎康丸組大鼠實(shí)驗(yàn)用

7、量設(shè)定為1.1g·kg-1大鼠體重,腎康丸研磨后用蒸餾水配成0.22g·mL-1混懸液。美卡素片組大鼠實(shí)驗(yàn)用量設(shè)定為7.2mg·kg—1大鼠體重,美卡素片研磨后用蒸餾水配成2.9mg·mL-1溶液。模型對(duì)照和正常對(duì)照組大鼠灌服等容積生理鹽水。每日1次,連續(xù)8w。各組大鼠自由進(jìn)食飲水,實(shí)驗(yàn)中不予任何降血糖藥物。治療期間及治療后觀察大鼠一般狀況、血糖、尿糖。末次給藥后計(jì)24h尿量和飲水量,然后用10％水合氯醛腹腔麻醉大鼠,腹主動(dòng)脈穿刺采血,

8、分離血清,全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、血總膽固醇(TC)、血甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-c)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL—c)；用紫外分光光度法檢測(cè)糖化血紅蛋白(GHb)；考馬斯亮蘭法檢測(cè)24h尿蛋白(Upro)；取大鼠腎臟,觀察腎臟大小,計(jì)算腎重、相對(duì)腎重,并通過HE染色法觀察大鼠腎臟組織病理變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.46只大鼠用于造模,成模率78.9％(30/

9、38),成模后病死率4.67％(2/30)。
　　 2.8周治療期間,模型組大鼠血糖均維持在16.7mmol·L-1以上,尿糖+++以上,表現(xiàn)出多飲、多食、多尿、消瘦的DM癥狀,腎康丸、美卡素治療組大鼠一般情況均較模型對(duì)照有所改善。
　　 3.正常對(duì)照組及各治療組大鼠體重均較治療前增加(均P<0.05),與模型對(duì)照組相比較,腎康丸組與美卡素組增長量顯著增加(均P<0.05)。
　　 4.與正常對(duì)照組比較,各組大鼠

10、血糖、GHb、24hUpro、Scr、BUN、TC、TG、LDL-c均顯著升高(均P<0.05),24h尿量及飲水量增加(均P<0.05)；與模型對(duì)照組比較,腎康丸、美卡素治療均可以降低24hUpro、BUN、Scr及24h尿量及飲水量(均P<0.05)；腎康丸治療可以降低血糖、GHb(均P<0.05)；各組中,僅腎康丸組TC、TG、LDL-c顯著下降(均P<0.05)。
　　 5.與正常對(duì)照組比較,各組大鼠HDL-c顯著降低(

11、均P<0.05)。與模型對(duì)照組相比,僅腎康丸治療組對(duì)HDL-c具有顯著升高作用(P<0.05)
　　 6.與正常對(duì)照組比較,模型組大鼠腎重及相對(duì)腎重增加(P<0.05),且出現(xiàn)了相當(dāng)于Mogensen分期的3期左右DN病理損害；腎康丸、美卡素治療均可以降低模型大鼠腎重及相對(duì)腎重(均P<0.05)。腎康丸、美卡素組病理改變較模型組均有不同程度的減輕,其中腎康丸組效果更為顯著。
　　 結(jié)論:
　　 1.腎康丸能夠改善

12、實(shí)驗(yàn)性DN大鼠一般狀態(tài),具有一定的調(diào)節(jié)血糖、血脂代謝的作用。
　　 2.腎康丸能夠降低實(shí)驗(yàn)性DN大鼠尿蛋白,降低血清BUN及Scr水平,具有一定的保護(hù)腎功能作用。
　　 3.腎康丸能夠改善DN大鼠腎臟組織病理學(xué)改變,緩解腎臟病理損傷。
　　 第二部分腎康丸對(duì)DN大鼠腎臟NF-κB及MCP-1表達(dá)的影響
　　 目的:探討腎康丸對(duì)DN大鼠腎臟NF-κB及MCP-1表達(dá)的影響。
　　 方法:取第一部分各

13、組大鼠左腎組織,沿正中矢狀面剖開,用PBS沖洗干凈,除去包膜,投入10％甲醛中性緩沖液中固定,應(yīng)用SP(過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素Streptavidin/Peroxidase)法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,一抗分別為兔抗大鼠NF-κ B、MCP—1、多克隆抗體。檢測(cè)腎臟組織NF-κB及MCP-1蛋白的表達(dá)。取20mg左右-70℃凍存腎組織,PBS沖洗干凈,冰浴中快速勻漿,按試劑盒說明書提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)依照Promega公司提供的逆轉(zhuǎn)

14、錄系統(tǒng)試劑盒說明書進(jìn)行。取1.5μg總RNA采用M-MLV轉(zhuǎn)錄成cDNA,采用SYBR Premix Ex TaqTM在FTC-2000型實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT—PCR)儀上進(jìn)行熒光定量PCR,內(nèi)參照采用GAPDH,檢測(cè)腎臟組織NF-κB及MCP-1mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.NF-κB、MCP-1在正常組腎組織內(nèi)極少量表達(dá)；與正常組大鼠相比,模型組NF-κB、MCP-1在腎小球內(nèi)、腎間質(zhì)、腎小管表達(dá)量增加

15、；與模型組比較,腎康丸組、美卡素組NF-κB、MCP-1在腎小球、腎間質(zhì)、腎小管表達(dá)量降低,其中腎康丸組效果明顯。
　　 2.與正常組比較,模型組大鼠腎臟NF-κB、MCP-1mRNA表達(dá)量增加；與模型組比較,腎康丸組、美卡素組大鼠腎臟NF-κB、MCP-1mRNA的表達(dá)量降低。
　　 結(jié)論:
　　 1.腎康丸可以下調(diào)DN大鼠腎臟組織NF-κ BmRNA及蛋白表達(dá)。
　　 2.腎康丸可以下調(diào)DN大鼠腎臟組

16、織MCP-1mRNA及蛋白表達(dá)。
　　 第三部分腎康丸對(duì)高糖刺激的大鼠腎小球系膜細(xì)胞NF-κB及MCP-1表達(dá)的影響
　　 目的:探討腎康丸對(duì)高糖刺激的大鼠腎小球系膜細(xì)胞(Mesangial cell,MC)NF-κB及MCP-1表達(dá)的影響。
　　 方法:1.藥物血清制備:16只大鼠隨機(jī)分為4組,通過給予大鼠分別灌服腎康丸、美卡素和生理鹽水7天后,分離藥物血清,制備腎康丸高、低劑量含藥血清、陽性對(duì)照美卡素含藥血清

17、和空白血清。
　　 2.MC培養(yǎng)分組:購自武漢大學(xué),取第4～8代細(xì)胞隨機(jī)分為6組:正常葡萄糖組、高糖刺激組、高糖刺激加正常血清組、美卡素含藥血清組、腎康丸高劑量組、腎康丸低劑量組,每組6孔,以相應(yīng)的試劑及藥物血清干預(yù)24小時(shí)后,吸取上清,提取核蛋白,并提取細(xì)胞總RNA。
　　 3.酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)法檢測(cè)細(xì)胞核蛋白NF-κB及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MCP-1的濃度。
　　 4.RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中NF-κ

18、BmRNA和MCP-1mRNA表達(dá):Trizol法提取和純化MC總RNA,以0.1％DEPC處理水50μl溶解后分裝,加RNAin保存于-70℃冰箱。設(shè)計(jì)NF-κB、MCP-1及內(nèi)參GAPDH引物序列,取總RNA5μl進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)依照Promega公司提供的逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)試劑盒說明書進(jìn)行。采用SYBR Premix Ex TaqTM在FTC-2000型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行熒光定量PCR,內(nèi)參照采用GAPDH,檢測(cè)MC中NF-

19、κB及MCP-1mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.與正常葡萄糖組比較,高糖組MC細(xì)胞核蛋白提取物中NF-κB表達(dá)增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與高糖組比較,腎康丸高、低劑量組及美卡素組MC核蛋白提取物中NF-κB含量減少,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；正常大鼠血清組與高糖組比較,MC核蛋白提取物中NF-κB的含量變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 2.與正常葡萄糖組比較,高糖組MC上清液中MC

20、P-1表達(dá)增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與高糖組比較,腎康丸高、低劑量組及美卡素組MC上清液中MCP-1含量減少,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),其中腎康丸高劑量組作用明顯；正常大鼠血清組與高糖組比較,MC上清液中MCP-1的含量變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 3.與正常葡萄糖組比較,高糖組MC中NF-κB、MCP-1mRNA表達(dá)增加,腎康丸含藥血清、美卡素含藥血清組可降低NF-κB、MCP-1mRNA的表達(dá),其

21、中以腎康丸高劑量含藥血清組效果明顯。
　　 結(jié)論:
　　 1.腎康丸可以下調(diào)高糖刺激的MC中升高NF-κBmRNA及蛋白表達(dá)。
　　 2.腎康丸可以下調(diào)高糖刺激的MC中升高M(jìn)CP-1mRNA及蛋白表達(dá)。
　　 全文結(jié)論:本研究通過DN動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)研究,再次證明腎康丸具有治療DN和保護(hù)腎臟的作用；通過觀察腎康丸對(duì)DN大鼠腎臟及體外高糖培養(yǎng)的MC細(xì)胞中NF-κB和MCP-1的表達(dá)情況,提示其可抑制NF-κ B