乙肝病毒X基因(HBVX)慢病毒載體的構(gòu)建和鑒定.pdf

1、目的：構(gòu)建在正常組織來源的肝細(xì)胞HL7702表達(dá)的乙型肝炎病毒（HBV）X蛋白的基因HBVX的重組慢病毒載體，研究其在體外的感染效率。
　　 方法:采用PCR技術(shù)從先前構(gòu)建的載體真核表達(dá)載體pcDNA3-X中擴(kuò)增出含HBVX基因的DNA片段，用In-Fusion技術(shù)構(gòu)建表達(dá)載體，經(jīng)PCR、酶切和單向測序驗(yàn)證。利用jetPEI轉(zhuǎn)染試劑三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，有限稀釋法計(jì)算慢病毒顆粒的滴度。用慢病毒液感染正常組織來源的肝細(xì)胞HL7

2、702，96 h后初步觀察慢病毒顆粒的感染情況。Real-time PCR和Western blot法檢測重組細(xì)胞HBV X基因的表達(dá)。
　　 結(jié)果:成功構(gòu)建HBVX基因的慢病毒表達(dá)載體，經(jīng)293T細(xì)胞包裝后，慢病毒顆粒濃縮后滴度為4x107IU/m1。用滴度為4x107IU/m1的慢病毒感染正常組織來源的肝細(xì)胞HL7702 96h后，被感染的細(xì)胞內(nèi)可見強(qiáng)弱不等的熒光。Real-time PCR和Western blot檢測均證