人基因組近端粒序列克隆解析.pdf

1、端粒是由端粒重復(fù)序列和大量與端粒相互作用的結(jié)合蛋白組成的復(fù)合體，在真核生物線性染色體末端形成類似帽子的結(jié)構(gòu)來維持染色體穩(wěn)定。端粒DNA由雙鏈和單鏈G懸突兩部分組成，人類的端粒重復(fù)單元為TTAGGG。單鏈懸突會(huì)形成D環(huán)、T環(huán)或者G四聯(lián)體的高級(jí)結(jié)構(gòu)，與端粒相關(guān)結(jié)合蛋白結(jié)合提高穩(wěn)定性防止染色體末端融合或斷裂。由于末端復(fù)制的問題，端粒會(huì)隨著細(xì)胞分裂而逐漸縮短。生物體主要靠端粒酶逆轉(zhuǎn)錄延伸端粒末端，但端粒酶在大多體細(xì)胞中活性很低，當(dāng)端?？s短到臨界

2、長(zhǎng)度時(shí)，會(huì)導(dǎo)致染色體降解、細(xì)胞的衰老和相關(guān)疾病的發(fā)生等，“生命時(shí)鐘”的稱呼由此而來。因此，端粒的長(zhǎng)度是研究端粒的一個(gè)重要生物標(biāo)簽。分析端粒長(zhǎng)度的方法有很多，目前有較高分辨率和較廣應(yīng)用范圍的單個(gè)端粒長(zhǎng)度分析需要在端粒上游的近端粒區(qū)域設(shè)計(jì)特異引物，再利用PCR擴(kuò)增端粒片段，進(jìn)而分析端粒的長(zhǎng)度。另一種方法也是基于PCR技術(shù)，通過在端粒末端添加接頭，結(jié)合上游特異引物擴(kuò)增端粒全長(zhǎng)的方法可以精準(zhǔn)的獲得單個(gè)端粒長(zhǎng)度，也同樣需要獲得近端粒序列設(shè)計(jì)上游引

3、物。
　　近端粒是在端粒和基因組核心區(qū)域之間的序列，其范圍從幾kb到幾百kb不等，存在個(gè)體間的多樣性。人類的近端粒包含靠近端粒的段落重復(fù)區(qū)域，以及和它銜接的染色體特異的非重復(fù)區(qū)域。由于近端粒區(qū)域DNA序列組成的特殊性和基因組內(nèi)部有大量端粒重復(fù)序列存在等原因，大的亞克隆沒有覆蓋近端粒區(qū)域，導(dǎo)致近端粒序列難以定位。NCBI的數(shù)據(jù)庫中，人類基因組全部46個(gè)染色體末端中只有17個(gè)染色體近端粒能夠完成拼接組裝，包含與端粒銜接部分序列的組裝片

4、段也只有25個(gè)。除了在端粒長(zhǎng)度分析中的應(yīng)用，近端粒序列還有例如表觀修飾、端粒相關(guān)調(diào)控和基因的遺傳和變異等研究?jī)r(jià)值。區(qū)別于酵母或水稻，人類的端粒和近端粒比較長(zhǎng)，這也是造成近端?？寺y(cè)序困難的原因之一。因此，克隆、測(cè)序人類的近端粒對(duì)于別的物種近端?？寺』驕y(cè)序有更廣泛的借鑒意義。
　　本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了6種策略對(duì)人類近端粒進(jìn)行克隆，總結(jié)對(duì)比了其優(yōu)劣，旨在建立一種方便高效的近端粒序列克隆方法。采用“隨機(jī)引物與端粒接頭克隆近端粒序列”的方法需要相

5、對(duì)低的退火溫度，降低了端粒接頭的特異性，盡管在水稻中獲得了成功，但在人類基因組中擴(kuò)增了太多的非近端粒片段?！跋拗菩悦盖信c去G懸突端粒直接克隆近端?！钡姆椒?，理論上避免了PCR擴(kuò)增產(chǎn)生非特異片段的情況，但是可能由于人類端粒長(zhǎng)度太長(zhǎng)、連接片段數(shù)太少等問題。“限制性酶切接頭與端粒重復(fù)序列引物克隆近端粒序列”的方法提高了PCR的特異性，但由于基因組內(nèi)源端粒重復(fù)序列的存在，無法直接說明獲得片段是否為近端粒序列。“限制性酶切接頭與突變端粒序列引物”

6、的策略是對(duì)“限制性酶切接頭與端粒重復(fù)序列引物”降低PCR產(chǎn)物彌散程度的改進(jìn)，但同樣無法排除基因組內(nèi)源端粒重復(fù)序列的干擾。為了克服內(nèi)源端粒重復(fù)序列的干擾，采用“限制性酶切接頭與端粒接頭”的策略克隆近端粒序列，排除了內(nèi)源端粒重復(fù)序列的干擾，但由于近端粒酶切位點(diǎn)的缺乏和人類端粒平均長(zhǎng)度較長(zhǎng)的問題，影響PCR的有效擴(kuò)增?！吧嫌伪Ｊ匦蛄信c端粒接頭克隆近端粒序列”利用近端粒區(qū)域的同源性和人類染色體末端高頻的交叉互換，在已知的染色體近端粒區(qū)域設(shè)計(jì)引物