山莨菪堿對(duì)皮瓣缺血再灌注損傷保護(hù)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：通過(guò)建立大鼠腹部皮瓣缺血再灌注損傷模型，觀察山莨宕堿注射液對(duì)大鼠缺血再灌注皮瓣成活面積及組織學(xué)變化的影響，并通過(guò)測(cè)定皮瓣組織中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素(ET)、腫瘤壞死因子(TNF-α)及核因子(NF)-κ B的含量，以期證實(shí)山莨宕堿具有防治皮瓣壞死、提高皮瓣成活率的療效，并為臨床防治各種組織瓣出現(xiàn)的缺血再灌注損傷，提高移植成活率提供新的思路和理論依據(jù)。
　　方法：
　　1實(shí)

2、驗(yàn)動(dòng)物：雄性健康清潔級(jí)Wistar大鼠48只，體重250～300g(購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，予以編號(hào)。
　　2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：把48只大鼠隨機(jī)分為三組，每組16只。(1)缺血再灌注(ischemia reperfusion IR)組術(shù)前3天至術(shù)后3天，腹腔注射生理鹽水2ml/kg，3/日，皮瓣形成后，用微血管夾夾閉腹壁淺動(dòng)脈發(fā)出點(diǎn)近側(cè)端的股動(dòng)脈，皮瓣原位縫合，10h后去除動(dòng)脈夾，恢復(fù)血供。(2)山莨宕堿缺血再灌注處理(Ani

3、-ischemia reperfusion Ani-IR)組腹腔注射0.1％山莨宕堿注射液，劑量為8mg/kg，其余操作同IR組。(3)對(duì)照組，皮瓣形成后原位縫合，不做其他處理。
　　3皮瓣制備方法：動(dòng)物術(shù)前三天應(yīng)用8％硫化鈉進(jìn)行腹部脫毛，以2％戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉。大鼠仰臥，四肢固定，75％酒精消毒，按照Petry JJ等描述的方法，于右下腹設(shè)計(jì)一大小為6cm×3cm軸形皮瓣，切開(kāi)皮瓣四周皮膚，僅保留腹壁淺血

4、管為皮瓣軸心，在皮下肉膜層剝離皮瓣，沿腹壁淺血管向近端分離，找到與股主動(dòng)脈的交匯點(diǎn)，并向近端游離股動(dòng)脈1cm，在此處用微血管夾夾閉股動(dòng)脈(顯微鏡下確認(rèn)股動(dòng)脈被完全夾閉)，然后將皮瓣原位縫合。
　　4取材：IR組和Ani-IR組每組取8只大鼠，在皮瓣切開(kāi)后即刻、去除血管夾再灌注2小時(shí)、8小時(shí)及24小時(shí)各時(shí)間點(diǎn)于皮瓣中段取材，對(duì)照組取8只大鼠與IR組和Ani-IR組同時(shí)取材，把所取的皮瓣組織分為兩部分，一部分放入超低溫冰箱冰凍保存，待

5、取材完畢后用于生化檢測(cè)；另一部分給予4％多聚甲醛固定，待取材完畢后用于做石蠟切片及檢測(cè)皮瓣中免疫組化指標(biāo)；每組剩余的8只大鼠用于肉眼觀測(cè)術(shù)后皮瓣變化情況及7天后分析測(cè)量皮瓣成活率。
　　5檢測(cè)方法及指標(biāo)：
　　5.1皮瓣肉眼觀察：術(shù)后第7天皮瓣成活情況已基本確定，用肉眼觀察皮瓣顏色、溫度、質(zhì)地及出血情況，并進(jìn)行大致判斷。
　　5.2皮瓣成活率測(cè)定：術(shù)后第7天用數(shù)碼相機(jī)對(duì)皮瓣進(jìn)行攝像，并把信息并輸入電腦，使用Image-

6、Pro Plus.v6.0軟件，分析并測(cè)定皮瓣成活率(皮瓣成活率＝皮瓣存活面積/皮瓣總面積×100％)。
　　5.3皮瓣組織學(xué)檢查：將制備好的石蠟切片進(jìn)行HE染色，電子顯微鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)變化情況。
　　5.4皮瓣組織生化檢測(cè)：按照不同試劑盒說(shuō)明書(shū)，分別檢測(cè)不同時(shí)刻所取皮瓣組織中SOD、MDA、NO、ET含量，考馬斯亮藍(lán)液中加入皮瓣組織測(cè)定吸光度，用于蛋白定量。所有生化檢測(cè)SOD、MDA、NO、ET值均經(jīng)考馬斯亮藍(lán)蛋白校正。

7、
　　5.5 TNF-α及NF-κ B測(cè)定：所取組織進(jìn)行免疫組化染色，光鏡觀察TNF－α及NF-κ B表達(dá)量和分布情況。應(yīng)用HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)軟件，每張切片隨機(jī)取5個(gè)互不重疊的400倍視野，測(cè)其陽(yáng)性細(xì)胞光度值后求其平均數(shù)。
　　6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)以x-±S表示，用SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)處理，皮瓣成活率、MDA、SOD、NO、ET、TNF-α、NF-κB數(shù)據(jù)采用單因素方差分析法，組間采用q檢

8、驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1皮瓣肉眼觀察：
　　術(shù)后第7天，IR組皮瓣除近端少許組織成活，其余絕大部分呈黑褐色，質(zhì)地干燥呈痂皮狀，無(wú)彈性，無(wú)毛發(fā)生長(zhǎng)，觸之溫度明顯較正常皮膚低，5號(hào)注射器針頭刺入無(wú)出血。掀起皮瓣，可見(jiàn)皮瓣下有較多炎性分泌物。Ani-IR組皮瓣成活面積明顯大于IR組，可見(jiàn)大部分皮瓣生長(zhǎng)良好，水腫較輕，顏色及質(zhì)地正常，可見(jiàn)毛發(fā)生長(zhǎng)，皮溫較正常，5號(hào)注射器針頭刺入可見(jiàn)鮮紅色血液流出

9、；僅遠(yuǎn)端呈暗褐色，質(zhì)地較韌，無(wú)彈性，無(wú)出血，呈壞死狀；掀起皮瓣可見(jiàn)成活皮瓣邊緣及基底有活動(dòng)性出血，僅壞死區(qū)域存在少量炎性分泌物。對(duì)照組皮瓣顏色淡紅，溫度及質(zhì)地正常，可見(jiàn)毛發(fā)生長(zhǎng)，未見(jiàn)壞死。
　　2皮瓣成活率：IR組(35.1±6.1)％，Ani－IR組(78.6±7.3)％，對(duì)照組100％，Ani－IR組與IR組成活率比較有顯著性差異(P<0.05)。
　　3組織學(xué)檢查：對(duì)照組各時(shí)段皮下組織水腫較輕，炎癥反應(yīng)輕，未見(jiàn)壞死征象

10、。Ani-IR組術(shù)后2h，表皮開(kāi)始出現(xiàn)角質(zhì)層剝脫，局部輕微破損；8h皮下組織水腫明顯，皮膚各層結(jié)構(gòu)疏松、紊亂，少量嗜中性粒細(xì)胞粘附、聚集于血管壁，部分微血管管壁損傷，完整性破壞，通透性增加，可見(jiàn)嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)到組織間隙；24h情況較前略有好轉(zhuǎn)，但仍有大量嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。IR組：各時(shí)段組織損傷均較Ani-IR組重，24h表皮層已經(jīng)部分壞死，結(jié)構(gòu)破壞，大量微血管管壁損傷，通透性增加，組織間隙有更多的嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　4組織生

11、化檢查：
　　4.1 SOD測(cè)定：制成皮瓣即刻測(cè)量三組皮瓣組織中SOD含量，結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)；再灌注后2小時(shí)、8小時(shí)、24小時(shí)，對(duì)照組術(shù)后12小時(shí)、18小時(shí)、34小時(shí)各時(shí)間點(diǎn)測(cè)得SOD值均呈現(xiàn)：Ani-IR組>IR組>對(duì)照組(P均<0.05)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.2 MDA測(cè)定：制成皮瓣即刻測(cè)量三組皮瓣組織中MDA含量，結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)；再灌注后2小時(shí)、8小時(shí)、2

12、4小時(shí)，對(duì)照組術(shù)后12小時(shí)、18小時(shí)、34小時(shí)各時(shí)間點(diǎn)測(cè)得MDA值均呈現(xiàn)：IR組>Ani－IR組>對(duì)照組(P均<0.05)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.3 NO測(cè)定：制成皮瓣即刻測(cè)量三組皮瓣組織中NO含量，結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)；再灌注后2小時(shí)、8小時(shí)、24小時(shí)，對(duì)照組術(shù)后12小時(shí)、18小時(shí)、34小時(shí)各時(shí)間點(diǎn)測(cè)得NO值均呈現(xiàn)：對(duì)照組>Ani－IR組>IR組(P均<0.05)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4

13、.4 ET測(cè)定：制成皮瓣即刻測(cè)量三組皮瓣組織中ET含量，結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)；再灌注后2小時(shí)、8小時(shí)、24小時(shí)，對(duì)照組術(shù)后12小時(shí)、18小時(shí)、34小時(shí)各時(shí)間點(diǎn)測(cè)得ET值均呈現(xiàn)：IR組>Ani-IR組>對(duì)照組(P均<0.05)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5免疫組化染色結(jié)果：
　　5.1 NF-κB測(cè)定：制成皮瓣即刻不同實(shí)驗(yàn)組皮瓣檢測(cè)NF-κB均未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)，再灌注2小時(shí)IR組、Ani-IR組中性粒細(xì)胞和血

14、管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)NF-κB較強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。IR組和Ani-IR組再灌注后2小時(shí)、8小時(shí)，對(duì)照組術(shù)后12小時(shí)、18小時(shí)各時(shí)間點(diǎn)測(cè)得NF-κB平均光度值均呈現(xiàn)：IR組>Ani-IR組>對(duì)照組(P均<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5.2腫瘤壞死因子(TNF-α)測(cè)定：掀起皮瓣后即刻三組均見(jiàn)TNF-α在血管內(nèi)皮細(xì)胞上有極少量的表達(dá)，但其表達(dá)量較小，無(wú)法定量。再灌注2小時(shí)IR組、Ani-IR組上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)TNF-α較強(qiáng)陽(yáng)性表