基于代謝組學技術的暈動病發(fā)生機制探討.pdf

1、暈動病是指機體暴露于異常加速度運動而引起的以植物神經(jīng)反應（惡心、嘔吐、眩暈）為主的癥狀和體征。暈船作為暈動病最常見的一種形式，雖不致于造成生命危險，但它導致艦船工作人員極度不適，加重體力消耗，造成過度疲勞，嚴重影響艦船工作人員的工作效率,是海上事故發(fā)生的重要原因之一,也是部隊登島作戰(zhàn)非戰(zhàn)斗減員的主要因素，因此暈動病發(fā)生機制研究一直受到國內(nèi)外尤其是軍隊的重視。迄今為止用于解釋暈動病發(fā)生機制的理論主要有感覺沖突-失匹配理論，毒物探測假說，神

2、經(jīng)遞質假說，牽涉性內(nèi)臟不適假說等。上述幾種理論都沒有完全闡明暈動病發(fā)生的機制。
　　 應激可以引起機體血清代謝產(chǎn)物的變化。有研究表明，暈動病發(fā)生過程中存在著應激反應，其過程中代謝產(chǎn)物變化規(guī)律還不明確。研究證實，血液中代謝產(chǎn)物可以反映機體的正常生理變化和疾病的病理生理影響，有助于闡明其潛在的分子機制。
　　 目的：
　　 本實驗運用代謝組學方法了解加速度暴露過程中出現(xiàn)暈動病癥狀受試者和沒有出現(xiàn)暈動病癥狀受試者暴露前

3、后的血液代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律，同時觀察血液中調(diào)控代謝的應激激素在異常加速度暴露前后的變化規(guī)律, 并在此基礎上通過動物實驗觀察上述代謝產(chǎn)物及調(diào)控代謝的應激激素的變化對機體加速度暴露耐受力的影響，為闡明加速度暴露后暈動病的發(fā)生機制提供線索。
　　 方 法：
　　 1．暈動病與無暈動病人群加速度暴露前后血清代謝產(chǎn)物比較
　　 1.1受試對象和倫理學聲明
　　 在我陸軍某營招募男性志愿者60名。所有受試對象均同意參

4、加試驗并填寫《知情同意書》。本試驗經(jīng)我校(第二軍醫(yī)大學)倫理委員會同意進行。實驗前24小時禁食高嘌呤含量的食物和碳酸飲料。試驗前一天18點晚餐后停止進食，21點統(tǒng)一就寢。
　　 1.2加速度暴露
　　 受試者在測量血壓、心率、身高、體重、體溫之后，分4批進入六自由度艦船運動模擬器(艙長3m，寬4m，高2.5m), 入座, 適應5分鐘后進行加速度（正弦波，頻率0.26HZ，加速度0.27g）暴露15分鐘。試驗時間為上午9:

5、00至10:30。當時環(huán)境溫度為15.2℃，艙內(nèi)溫度為18.0℃。加速度暴露后，我們將出現(xiàn)惡心、嘔吐癥狀的受試者作為暈動病組，未出現(xiàn)惡心、嘔吐的受試者作為無暈動病組。
　　 1.3 血液樣品GC-TOF/MS分析
　　 分別采集受試者加速度暴露前和加速度暴露后即刻的靜脈血各5ml，4℃離心20min（3000rpm），取上清液，置于-80℃保存。取血清 100μL，加入內(nèi)標氯苯丙氨酸和十七酸各10μL，震搖均勻；加入氯仿

6、和甲醇的混合溶劑（氯仿：甲醇=3：1）300μL，再次震搖均勻，-20℃靜置 10min，室溫離心 10min (10,000rpm)；取 300μL上清液置于進樣瓶，真空干燥。在干燥后的進樣瓶中加入 80μL含甲氧胺（15mg/mL）的吡啶溶液，在37℃下反應90min，再加入 80μL BSTFA（含1％TMCS），于 70℃下反應 60min后進樣分析。
　　 本實驗采用GC-TOF/MS (LECO Corporatio

7、n, St. Joseph, MI, USA) 檢測血液樣品中的代謝物。加速度暴露前后樣本間隔進樣。GC進樣口溫度：270℃。載氣為超純氦。流量為1ml/min。MS接口溫度：260℃。離子源溫度：200℃。質譜掃描范圍:30～600（M/Z）。氣相色譜的程序升溫條件：起始溫度：80℃，保留2分鐘，10℃/min升至180℃，6℃/min升至230℃，40℃/min升至295℃，保留9分鐘。
　　 1.4 數(shù)據(jù)分析
　　

8、 檢測所得數(shù)據(jù)首先通過DataBridge軟件（Perkin-Elmer Inc.）直接轉化成NETCDF格式，然后輸入MATLAB(The MathWorks, Inc.)進行基線校正、峰識別、對齊、內(nèi)標排除和均一化，得到一個由指定的峰序列號、觀測點以及歸一化后的峰強度組成的三維矩陣，然后將其導入SIMCA-P軟件后進行多維統(tǒng)計分析。我們運用PCA觀察樣品的聚集、離散和離群點，通過OPLS-DA來鑒別造成聚集和離散的主要差異變量。同時

9、，為了保證在單維統(tǒng)計上有意義，運用配對t檢驗和Wilcoxon符號秩檢驗來檢驗得到的主要差異變量，以兩者P值均小于0.05的變量作為檢驗標準。運用配對t檢驗或Wilcoxon符號秩檢驗分析上述主要差異變量在兩組各自暴露前后的變化水平, 運用獨立樣本t檢驗或Wilcoxon秩和檢驗分析暴露前兩組人群之間和暴露后兩組人群之間上述主要差異變量的變化特點。
　　 2.暈動病與無暈動病人群加速度暴露前后血清中調(diào)控代謝的應激激素比較

10、　　 2.1放射免疫法測定血清中胰島素、胰高血糖素、皮質醇含量
　　 胰島素、胰高血糖素和皮質醇放免試劑盒購自北京北方生物技術研究所。
　　 2.2 ELISA測定血清中腎上腺素含量
　　 腎上腺素ELISA試劑盒購自北京天漠科技開發(fā)有限公司。
　　 3.血糖濃度變化對實驗大鼠暈動病嚴重程度的影響
　　 3.1實驗動物分組
　　 雄性SD大鼠（250-300g），購自上海斯萊克實驗動物有

11、限責任公司。對100只大鼠進行加速度暴露30min，記錄暈反應指數(shù)。根據(jù)暈反應指數(shù)選出暈動病敏感大鼠（暈反應指數(shù)>9）作為實驗大鼠，脫適應14天后，再將其隨機分為三組：模型組（n=14）：單純給予加速度刺激；胰島素組（n=14）：加速度刺激前30分鐘，給予大鼠腹腔注射胰島素（1unit/kg）；空白對照組（n=8）：不給予加速度刺激。
　　 3.2 加速度暴露
　　 將模型組和胰島素組大鼠放入按Crampton等報道仿制

12、的旋轉裝置內(nèi)，繞垂直軸順時針旋轉，以16°/s2 角加速度加速至120°/s2，再以48°/s2角減速度減速至零，交替加、減速進行，持續(xù)30分鐘。
　　 將空白對照組大鼠放入旋轉裝置，靜置30分鐘。實驗結束后立即檢測大鼠的暈反應指數(shù)并斷頭處死，測量血糖值。大鼠血液樣本4℃離心20min（3000rpm），取上清液，置于-80℃保存。
　　 3.3 暈反應指數(shù)評分標準
　　 暈反應指數(shù)評分標準：排糞（粒）無計為0分

13、，有，每粒計1分；排尿無計0分，有計1.2分；立毛無計0分，輕度計0.6分，重度計1.2分；顫抖無計0分，有計1.2分。暈反應指數(shù)評分為各項積分的總和。
　　 3.4 使用羅氏全活力型血糖儀測定大鼠血糖值。
　　 3.5大鼠血清胰島素、胰高血糖素、皮質酮和腎上腺素含量檢測方法同人體試驗。
　　 4.統(tǒng)計分析
　　 自身暴露前后數(shù)據(jù)比較采用配對t檢驗或Wilcoxon符號秩檢驗; 暴露前或暴露后兩組間的數(shù)據(jù)

14、比較采用獨立樣本t檢驗或Wilcoxon秩和檢驗。三組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD Post hoc。
　　 結 果
　　 1．暈動病與無暈動病人群加速度刺激前后血清代謝物組比較
　　 1.1暈動病發(fā)生情況
　　 加速度暴露后有30名受試者出現(xiàn)了明顯的暈動病癥狀，還有30名受試者沒有出現(xiàn)明顯的暈動病癥狀。
　　 1.2 60名受試者自身加速度暴露前后血清代謝物組比較
　　 60名

15、受試者加速度暴露后血清中有35種代謝物與其自身暴露前相比發(fā)生了變化，血清中肌苷、次黃嘌呤、尿素、乙醇酸、肌酸肝、丙氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、色氨酸、組氨酸、纈氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、4-羥基-脯氨酸、肌酸酐、3-羥基異丁酸、碳二亞胺、反丁烯二酸、L-2-氨基丁酸、焦谷氨酸水平明顯降低，而血清亞油酸、硬脂酸、反油酸、棕櫚酸、油酸、花生四烯酸、n-十二烷酸、n-十四烷酸、β-羥基丁酸、丙酮酸、葡萄糖含量明顯升高

16、。
　　 1.3 暈動病組與無暈動病組受試者加速度暴露前后自身血清35種代謝產(chǎn)物變化水平比較
　　 為探索兩組受試者可能存在的生理變化或病理生理變化特點，我們對暈動病組和無暈動病組受試者各自暴露前后上述35種代謝產(chǎn)物的變化狀況進行了比較。兩組受試者加速度暴露后包括葡萄糖、丙酮酸在內(nèi)的26種代謝產(chǎn)物發(fā)生了相同的變化。同時我們發(fā)現(xiàn)兩組間有9種代謝產(chǎn)物在加速度暴露變化趨勢不一致。無暈動病組受試者血清尿素含量明顯降低，而暈動病組

17、則沒有明顯變化。相反，暈動病組受試者血清組氨酸、鳥氨酸、絲氨酸、酪氨酸、反丁烯二酸、焦谷氨酸含量明顯降低，血清n-十二烷酸、n-十四烷酸含量明顯升高，但無暈動病組加速度暴露前后上述代謝物含量卻沒有發(fā)生明顯變化。
　　 1.4加速度暴露前暈動病組與無暈動病組受試者間血清中35種代謝產(chǎn)物含量的比較
　　 在加速度暴露前，暈動病組人群血清中組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸以及鳥氨酸，苯丙氨酸，絲氨酸，酪

18、氨酸，焦谷氨酸以及反油酸，亞油酸，次黃嘌呤，肌酸肝，丙酮酸、3-羥基異丁酸、碳二亞胺的含量均明顯高于無暈動病組。
　　 1.5 加速度后暈動病組與無暈動病組受試者間血清中35種代謝產(chǎn)物含量的比較
　　 加速度暴露后，暈動病組受試者血清中異亮氨酸、蛋氨酸、鳥氨酸、肌酸肝、次黃嘌呤、丙酮酸、4-羥基-脯氨酸、油酸、尿素、葡萄糖含量明顯高于無暈動病組受試者。加速度暴露前的4-羥基-脯氨酸、油酸、尿素、葡萄糖血清含量在兩組人群之

19、間沒有顯著差異，但加速度暴露后暈動病組受試者血清中上述代謝物的含量明顯高于無暈動病組, 且在這4種代謝產(chǎn)物中，暈動病組受試者加速度暴露后葡萄糖的升高幅度要明顯大于無暈動病組（P<0.05）。
　　 2.暈動病與無暈動病人群加速度暴露前后血清中調(diào)控代謝的應激激素比較
　　 加速度暴露后暈動病組和無暈動病組受試者血清皮質醇和腎上腺素含量均較各自暴露前明顯升高，其中暈動病組皮質醇含量升高30％ (P<0.001)，腎上腺素含量

20、升高24％(P<0.001)，而無暈動病組皮質醇含量升高26％(P<0.001)，腎上腺素含量升高18％ (P<0.001)。另外，兩組人群暴露前血清胰島素含量存在差異，即無暈動病組血清胰島素含量明顯高于暈動病組 (P<0.05)。與各自暴露前相比，加速度暴露后無暈動病組人群血清胰島素含量下降了33％ (P<0.01)。暈動病組僅下降了17％ (P<0.01)。兩組受試者加速度暴露前后胰高血糖素含量沒有明顯變化，但無暈動病組（P<0.0

21、01）和暈動病組(P<0.05)。加速度暴露后胰高血糖素與胰島素的比值較各自暴露前明顯升高，而且無論是暴露前(P<0.01)還是暴露后(P<0.05)，無暈動病組胰高血糖素水平和胰高血糖素與胰島素的比值均明顯低于暈動病組。
　　 3.血糖濃度變化對實驗大鼠暈動病嚴重程度的影響
　　 胰島素組大鼠胰島素水平是模型組的3.88倍(P<0.001)，是空白對照組的2.57倍(P<0.001)，血糖水平明顯低于模型組(P<0.0

22、01)和空白對照組(P<0.001)，暈反應指數(shù)與模型組相比降低了33％(P<0.05)，但與空白對照組相比沒有明顯差異。加速暴露后胰島素組大鼠糖皮質激素、腎上腺素水平較空白對照組分別升高了49％(P<0.01)和421％ (P<0.001)，但與模型組相比沒有明顯差異。三組大鼠血清胰高血糖素水平雖然沒有明顯差異，但胰島素組大鼠胰高血糖素與胰島素比值，與模型組相比降低了71％ (P<0.001),與空白對照組相比降低了58％(P<0.0

23、01)。
　　 結 論：
　　 1.加速度暴露后60名受試者有35種代謝產(chǎn)物發(fā)生了明顯變化，主要包括在嘌呤代謝，氨基酸代謝，脂肪酸代謝和糖代謝通路中。
　　 2.加速度暴露后，兩組受試者有9種代謝產(chǎn)物變化有差異，這些代謝產(chǎn)物主要有：4種生糖氨基酸（組氨酸、鳥氨酸、絲氨酸、酪氨酸）、2種脂肪酸（n-十二烷酸、n-十四烷酸）以及尿素、反丁烯二酸和焦谷氨酸。
　　 3.暈動病人群血清中葡萄糖加速度暴露后的升高幅

24、度明顯大于無暈動病人群；加速度暴露過程中血糖濃度的大幅度升高可能與暈動病的胃腸道癥狀發(fā)生有關。
　　 4.加速度暴露可以導致兩組受試者血清中皮質醇和腎上腺素含量明顯升高，胰島素含量明顯下降，胰高血糖素與胰島素比值明顯升高；加速度暴露前，暈動病組受試者胰島素水平低于無暈動病組，胰高血糖素/胰島素比值高于無暈動病組。
　　 5. 加速度暴露前給予大鼠胰島素可緩解加速度暴露過程中血糖濃度的升高幅度，明顯減輕暈動病的胃腸道癥狀。