轉(zhuǎn)基因同種異體組織工程軟骨修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的初步研究.pdf

1、目的:應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將外源性人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因整合到兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的基因組中,使其獲得永生化,并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究。以基因轉(zhuǎn)染得到的永生化軟骨細(xì)胞為種子細(xì)胞,復(fù)合骨基質(zhì)明膠(Bone Matrix Gelatin,BMG)構(gòu)建組織工程軟骨,對(duì)其修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的能力進(jìn)行評(píng)價(jià),從而探討轉(zhuǎn)入hTERT基因的永生化軟骨細(xì)胞作為軟骨組織工程種子細(xì)胞的可行性及BMG作為軟骨組織工程支架材料的優(yōu)越性。
　　 方法:

2、
　　 1.分離、培養(yǎng)兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞并對(duì)其特有表型進(jìn)行鑒定。通過陽(yáng)離子脂質(zhì)體將pLEGFP-C1-hTERT質(zhì)粒與-pVSV-G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染GP2-293包裝細(xì)胞,并對(duì)轉(zhuǎn)染后72小時(shí)內(nèi)收集到的病毒上清進(jìn)行濃縮,再感染分離得到的第2代兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞,并觀察轉(zhuǎn)染后GP2-293細(xì)胞和軟骨細(xì)胞綠色熒光蛋白GFP的表達(dá)。使用NIH3T3細(xì)胞對(duì)病毒原液和濃縮液進(jìn)行病毒滴度測(cè)定,并比較前后的變化。使用含有G418的培養(yǎng)液篩選被病毒濃縮液感染后

3、的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞,將得到的克隆擴(kuò)大培養(yǎng),并采用RT-PCR法檢測(cè)擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)hTERT基因的表達(dá)。擴(kuò)增后的軟骨細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)情況,繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和計(jì)算群體倍增時(shí)間來探討轉(zhuǎn)入hTERT基因?qū)?xì)胞增殖的影響。通過RT-PCR法和免疫組化染色來評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)入hTERT基因后軟骨細(xì)胞表型的變化情況和細(xì)胞因子BMP-4對(duì)轉(zhuǎn)染后軟骨細(xì)胞表型的影響。最后通過平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)入hTERT基因后對(duì)軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化傾向的影響。
　　

4、 2.制備兔骨基質(zhì)明膠BMG,將得到的BMG修剪后凍干,環(huán)氧乙烷滅菌后置于-80'C保存?zhèn)溆?。將永生化軟骨?xì)胞復(fù)合BMG生長(zhǎng),制備成細(xì)胞-載體復(fù)合物,并分別采用RT-PCR法和免疫組化法檢測(cè)細(xì)胞復(fù)合BMG生長(zhǎng)3天后Ⅱ型膠原的表達(dá)情況。8只雄性新西蘭兔隨機(jī)分成A、B兩組,建立雙側(cè)股骨滑車關(guān)節(jié)面軟骨缺損的模型,每個(gè)膝關(guān)節(jié)均有兩處軟骨缺損,包含實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。A組:實(shí)驗(yàn)組為永生化軟骨細(xì)胞復(fù)合BMG(A1),對(duì)照組為空白BMG(A2):B組:

5、實(shí)驗(yàn)組為永生化軟骨細(xì)胞復(fù)合BMG(B1),對(duì)照組為第2代軟骨細(xì)胞復(fù)合BMG(B2).分別于術(shù)后6周和12周取材,行大體觀察和Moran大體評(píng)分。
　　 結(jié)果:
　　 1.得到的兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞以多角形和三角形為主,胞漿豐富,具有良好的折光性,甲苯胺藍(lán)染色和Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果均呈陽(yáng)性。通過pLEGFP-C1-hTERT質(zhì)粒與pVSV-G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染(3P2-293包裝細(xì)胞,細(xì)胞內(nèi)可見綠色熒光蛋白GFP表達(dá),收集到的病

6、毒上清液經(jīng)濃縮后病毒滴度明顯提高。濃縮病毒液感染兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞72小時(shí)后見軟骨細(xì)胞胞漿中有成片黃綠色熒光蛋白表達(dá)。經(jīng)G418篩選4周后最終得到克隆并將其擴(kuò)增,已經(jīng)連續(xù)傳至25代,初步建立了永生化軟骨細(xì)胞系。而未經(jīng)轉(zhuǎn)染的第2代軟骨細(xì)胞經(jīng)(3418篩選1周后全部死亡。通過RT-PCR法能夠檢測(cè)到永生化軟骨細(xì)胞的hTERT基因在mRNA水平的表達(dá)。體外連續(xù)培養(yǎng)中,永生化軟骨細(xì)胞增殖活力提高,生長(zhǎng)速度加快,群體倍增時(shí)間縮短,而細(xì)胞體積縮小并逐漸

7、拉長(zhǎng),呈長(zhǎng)梭形或放射狀排列,Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈陰性,RT-PCR法幾乎檢測(cè)不到Ⅱ型膠原的mRNA表達(dá),標(biāo)化后的灰度值明顯低于正常第2代軟骨細(xì)胞組和加入 BMP-4的永生化軟骨細(xì)胞組(P＜0.05)。轉(zhuǎn)入hTERT基因的軟骨細(xì)胞在體外貼壁生長(zhǎng)的過程中具有接觸抑制性,克隆形成率僅為5.8％,遠(yuǎn)低于Hela細(xì)胞的克隆形成率,不具備惡性轉(zhuǎn)化傾向。
　　 2.制得的BMG呈疏松多孔隙的海綿狀結(jié)構(gòu),具有一定的韌性和強(qiáng)度,易被修剪成各

8、種需要的形狀。去分化的永生化軟骨細(xì)胞復(fù)合BMG體外培養(yǎng)3天后,Ⅱ型膠原能夠重新被翻譯、表達(dá)。手術(shù)后6周和12周A1、B1、B2均由軟骨樣組織修復(fù),關(guān)節(jié)面完整,修復(fù)組織與周圍正常軟骨整合滿意,而A2軟骨缺損處凹陷,其內(nèi)有少量灰白色透明樣物質(zhì)填充,周圍界限清楚。Moran大體評(píng)分結(jié)果顯示在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組(A1、B1)、正常陽(yáng)性對(duì)照組(B2)評(píng)分結(jié)果均明顯優(yōu)于空白BM(3對(duì)照組(A2),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。術(shù)后6周,實(shí)驗(yàn)組(

9、A1、B1)及正常陽(yáng)性對(duì)照組(B2)評(píng)分差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);術(shù)后12周,實(shí)驗(yàn)組(A1、B1)優(yōu)于正常陽(yáng)性對(duì)照組(B2),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。術(shù)后12周各組的得分均高于各自術(shù)后6周的得分(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.通過轉(zhuǎn)入外源性hTERT基因建立了永生化軟骨細(xì)胞系,關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞在體外培養(yǎng)的壽命顯著延長(zhǎng)。
　　 2.永生化軟骨細(xì)胞在體外單層培養(yǎng)的過程中表型逐漸丟失,細(xì)胞因子