牛皰疹病毒5型糖蛋白基因gG功能研究.pdf

1、BHV-1、BHV-5屬于皰疹病毒科、α皰疹病毒亞科、水痘病毒屬。BHV-1目前在世界范圍內(nèi)流行,除南美部分國家之外,世界各國都已分離到該病毒。該病毒引起以鼻氣管炎、高熱、流產(chǎn)、眼結膜炎、傳染性膿皰為特征的呼吸道疾病,還可引起外陰道炎、普遍的全身感染,每年給養(yǎng)牛業(yè)帶來的損失超過10億美元。BHV-5能夠引起牛致命性腦膜腦炎。BHV-5能進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS),能夠引起小牛嚴重的致死性的腦膜腦炎,引起成年牛亞臨床癥狀,給養(yǎng)牛業(yè)造成很大

2、的損失。
　　 gG是BHV的主要囊膜糖蛋白之一,它在α皰疹病毒中相對保守,gG可影響病毒在宿主細胞內(nèi)有效增殖與細胞間擴散,在體外與病毒在細胞間侵染有關,并且可以阻止細胞的凋亡,但BHV-1 gG和BHV-5 gG的趨化能力是否有差異還不明確,BHV-5 gG胞外區(qū)能夠和趨化因子結合,但具體的功能域尚不清楚。
　　 本研究構建了幾個突變株,通過動物試驗探討gG對BHV-5致病性的影響。利用桿狀病毒表達系統(tǒng)分段表達了BHV

3、-5 gG片段,進一步通過做趨化試驗,探討B(tài)HV-1 gG和BHV-5 gG的趨化能力的差異以及BHV-5 gG具有趨化功能的區(qū)域。主要工作包括:
　　 1.突變株的構建
　　 本試驗以牛皰疹病毒5型全基因組(基因登錄號為AY261359)為模板,設計引物,PCR擴增gG基因上游約1.0kb和下游1.1kb的片段作為同源重組臂,分別克隆到pMD18-T載體上。用相應的限制性內(nèi)切酶將下游同源臂片段回收,定向插入到含有上游同

4、源臂片段的載體中,構建中間轉移載體,命名為pZF09-13。然后在上下游同源臂中間插入帶有完整啟動子的EGFP報告基因,構建重組轉移質(zhì)粒,命名為pZF09-14。將pZF09-14線性化,回收含有上下游同源臂的序列,并將其與質(zhì)粒pBICP0和BHV-5基因組DNA用磷酸鈣轉染法在MDBK上共轉染,成功地進行了同源重組,經(jīng)過4輪篩選和純化獲得了BHv-5△gG/EGFP突變株。用同樣的方法成功構建BHV-5△gG/EGFP回復突變株和BH

5、V-1△gG/EGFP回復突變株。
　　 2.BHV-5 gG表達系統(tǒng)的建立
　　 將BHV-5 gG的蛋白序列用軟件分析,分為三段,分別設計引物,以pZF09-40為模板擴增各片段,將各片段分別克隆到pMD18-T載體上,經(jīng)測序鑒定后,原核表達系統(tǒng)表達,并用western驗證。再用限制性內(nèi)切酶酶切回收,克隆到pFastBacTM1載體,提取重組的bacmid,轉染sf9細胞,用PCR驗證重組桿狀病毒gG基因的插入,再感

6、染High—five細胞,經(jīng)western驗證,gG片段得到表達。gG1大小為27KD,gG2未表達,gG3大小為55KD。
　　 3.趨化試驗
　　 將BHV-5 wt、BHV-5△gG/EGFP、BHV-5△gG/EGFP rev、BHV-1 wt、BHV-1△gG/EGFP、BHV-1△gG/EGFP rev按1個MOI接種MDBK細胞,24h后,收獲上清,作為趨化反應樣品,將樣品與趨化因子同時加到趨化小室中,作用

7、30min,在上面小室中加中性粒細胞,45min后,計算趨化小室中的細胞數(shù),BHV-1和BHV-5組內(nèi)的三株病毒的趨化性無明顯差異。按上述方法檢測BHV-5 gG蛋白不同區(qū)段與趨化因子結合的能力,結果表明gG2結合能力較強。
　　 4.動物試驗
　　 試驗以新西蘭白兔為動物試驗模型,分兩組,一組用BHV-5 wt接種,另一組用BHV-5△gG/EGFP接種。每天觀察動物神經(jīng)癥狀,結果7dpi時BHV-5 wt組和BHV-