腫瘤淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞靶向成像的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、腫瘤內(nèi)的淋巴管生成也是影響腫瘤轉(zhuǎn)移、預(yù)后的一個(gè)重要因素，可作為腫瘤診斷、預(yù)后及療效評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。目前淋巴管的相關(guān)研究主要是通過淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞(lymphatic endothelial cell，LEC)表達(dá)的相關(guān)標(biāo)記物對(duì)腫瘤內(nèi)淋巴管進(jìn)行識(shí)別檢測(cè)，評(píng)價(jià)活體腫瘤內(nèi)淋巴管發(fā)生、發(fā)展以及與腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)系一直是淋巴管研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。雖然從理論上講，經(jīng)靜脈注入的CT(computedtomography)、磁共振(magnetic r

2、esonance，MR)造影劑可以進(jìn)入腫瘤細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)，經(jīng)過腫瘤新生淋巴管回流入靜脈系統(tǒng)，但因?yàn)槟[瘤內(nèi)血管同時(shí)成像，無(wú)法區(qū)分腫瘤內(nèi)淋巴管及微小血管。隨著分子影像學(xué)的出現(xiàn)與迅速發(fā)展，為活體評(píng)價(jià)腫瘤內(nèi)淋巴管生成提供了可能性。分子影像學(xué)是建立在傳統(tǒng)的成像技術(shù)基礎(chǔ)之上，以特殊的分子作為成像對(duì)象，其根本宗旨是將非特異性物理成像轉(zhuǎn)為特異性分子成像。如果能通過此成像技術(shù)對(duì)腫瘤內(nèi)的淋巴管進(jìn)行靶向成像，相信將對(duì)淋巴管與腫瘤關(guān)系的評(píng)估提供更豐富的依據(jù)。因此，

3、本研究的主要目的為構(gòu)建一種能夠靶向淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的磁共振分子影像探針，研究此探針應(yīng)用于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞磁共振靶向成像的可行性。
　　 材料與方法：
　　 腫瘤動(dòng)物模型的確定及抗體的篩選:分別建立Lewis小鼠皮下移植瘤模型及colon26小鼠皮下移植瘤模型，通過免疫組化檢測(cè)方法對(duì)Lewis、colon26小鼠腫瘤模型及抗淋巴管透明質(zhì)酸受體-1(lymphatic vessel endothelial hyaluronan

4、receptor-1，LYVE-1)單克隆抗體、抗podoplanin單克隆抗體進(jìn)行雙向選擇，篩選出一種淋巴管豐富的腫瘤模型及針對(duì)腫瘤內(nèi)淋巴管相對(duì)較為特異的抗體。
　　 分子探針的制備、表征分析及細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn):采用納米鐵高溫?zé)岱纸庵苽浞椒?，利用“一鍋”反?yīng)制備出表面修飾有聚乙二醇(polyehtylene glycol，PEG)的超微型超順磁性氧化鐵(ultrasmall superparamagenetic iron oxid

5、e，USPIO)磁性納米鐵顆粒PEG-USPIO，并將PEG-USPIO與抗LYVE-1單克隆抗體共價(jià)耦聯(lián)，制備本研究所設(shè)計(jì)的磁共振分子影像探針LYVE-1-PEG-USPIO。通過透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy, TEM)觀察PEG-USPIO及LYVE-1-PEG-USPIO兩種納米顆粒的形態(tài);激光粒度儀測(cè)定兩種納米顆粒的z平均水合粒徑及zeta電位;通過磁共振成像（magnetic

6、 resonance imaging，MRI）測(cè)定兩種納米顆粒的弛豫率。小鼠淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞（mouse lymphatic endothelial cell，MLEC）及colon26細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代;以25及100μg Fe/mL濃度的LYVE-1-PEG-USPIO及PEG-USPIO體外標(biāo)記MLEC及colon26細(xì)胞后經(jīng)普魯士藍(lán)染色，分別收集每組染色后的標(biāo)記細(xì)胞通過原子吸收光譜法（atomic absorption spectr

7、oscopy, AAS）測(cè)定細(xì)胞結(jié)合鐵量;TEM觀察LYVE-1-PEG-USPIO及PEG-USPIO納米顆粒在MLEC及colon26細(xì)胞內(nèi)的結(jié)合情況;對(duì)系列濃度的LYVE-1-PEG-USPIO及PEG-USPIO孵育的MLEC及colon26細(xì)胞懸液進(jìn)行MRI T2加權(quán)成像(T2 weighted imaging，T2WI)成像，研究MR信號(hào)改變與孵育探針濃度的關(guān)系，并利用AAS測(cè)定各組標(biāo)記細(xì)胞的結(jié)合鐵量，研究細(xì)胞結(jié)合鐵量與孵育

8、探針濃度的關(guān)系。
　　 分子探針MR體內(nèi)實(shí)驗(yàn):建立Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤模型，待腫瘤直徑約1.5-2.0cm時(shí)進(jìn)行MR掃描;10只小鼠注射LYVE-1-PEG-USPIO溶液，10只小鼠注射PEG-USPIO溶液，給藥前先進(jìn)行腫瘤軸位層面MR T2WI、SWAN、T2*WI序列掃描，給藥后于不同時(shí)間段進(jìn)行掃描;掃描完成后，留取腫瘤及肝、脾、肺、骨骼肌、舌、腎、胃及心肌組織標(biāo)本，行普魯士藍(lán)染色及免疫組化染色。
　　

9、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用spssl6.0軟件。數(shù)據(jù)中計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間計(jì)量資料差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。鐵含量與R2之間相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 腫瘤動(dòng)物模型的確定及抗體的篩選結(jié)果:Lewis小鼠腫瘤模型內(nèi)抗LYVE-1單克隆抗體及抗podoplanin單克隆抗體陽(yáng)性淋巴管豐富，但此腫瘤內(nèi)利用抗podoplanin單克隆抗

10、體染色除可見陽(yáng)性淋巴管外，還可見大量抗podoplanin單克隆抗體陽(yáng)性的細(xì)胞，而抗LYVE-1單克隆抗體染色結(jié)果中未見非淋巴管結(jié)構(gòu)的陽(yáng)性細(xì)胞著色。另外，colon26小鼠腫瘤模型內(nèi)未見兩種抗體陽(yáng)性染色的淋巴管結(jié)構(gòu)。
　　 分子探針的制備、表征分析及細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果:成功制備出LYVE-1-PEG-USPIO分子探針;通過TEM觀察PEG-USPIO及LYVE-1-PEG-USPIO兩種納米顆粒呈類圓形，顆粒大小較為一致;動(dòng)態(tài)光

11、散射法(dynamic light scattering，DLS)測(cè)定PEG-USPIO及LYVE-1-PEG-USPIO兩種納米顆粒的粒徑分別為47.91±0.73nm和57.42±0.31nm，zeta電位分別為2.57±0.83mV和12.38±4.87mV;經(jīng)MRI測(cè)定PEG-USPIO和LYVE-1-PEG-USPIO兩種納米顆粒的弛豫率分別為608.32 mM-1s-1和185.48 mM-1s-1。普魯士藍(lán)染色結(jié)果提示兩種

12、細(xì)胞對(duì)兩種納米顆粒的結(jié)合能力不同，AAS測(cè)定結(jié)果進(jìn)一步表明在給予兩種對(duì)比劑含鐵濃度相同條件下，MLEC對(duì)LYVE-1-PEG-USPIO的結(jié)合量最高;標(biāo)記細(xì)胞的TEM結(jié)果顯示LYVE-1-PEG-USPIO納米顆粒主要存在于MLEC細(xì)胞質(zhì)中的核內(nèi)體中，細(xì)胞膜外表面亦可見納米顆粒的結(jié)合，LYVE-1-PEG-USPIO納米顆粒主要結(jié)合于colon26細(xì)胞膜外表面，偶可見于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)核內(nèi)體中，而PEG-USPIO主要結(jié)合于MLEC及colon

13、26細(xì)胞膜外表面;MRI T2WI結(jié)果表明，隨著給予LYVE-1-PEG-USPIO或PEG-USPIO濃度的增加，MR T2信號(hào)減低，當(dāng)給予納米顆粒濃度等于或高于25μtg Fe/mL時(shí)，在同一濃度條件下以LYVE-1-PEG-USPIO標(biāo)記的MLEC信號(hào)減低較為明顯，AAS測(cè)定結(jié)果進(jìn)一步表明細(xì)胞結(jié)合鐵量隨給予納米顆粒濃度的增加而呈逐漸增高趨勢(shì)，當(dāng)給予納米顆粒濃度等于或高于25μg Fe/mL時(shí)，同一濃度條件下，MLEC對(duì)LYVE-1

14、-PEG-USPIO的結(jié)合量最為顯著(P＜0.05)，且MRI R2值與AAS測(cè)定細(xì)胞結(jié)合鐵量具有較好的相關(guān)性。
　　 分子探針MR體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:從注射LYVE-1-PEG-USPIO組及PEG-USPIO組的T2WI、SWAN、T2*WI掃描圖像可見腫瘤區(qū)信號(hào)強(qiáng)度從給藥10min后至12h期間逐漸減低，到24h時(shí)腫瘤區(qū)信號(hào)強(qiáng)度有所增加，但仍低于平掃時(shí)信號(hào)，SWAN序列掃描圖像中測(cè)得24h時(shí)兩組腫瘤的信號(hào)噪聲比值（Signal

15、to Noise Ratio，SNR）有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，而T2WI及T2*WI序列掃描圖像中測(cè)得24h時(shí)兩組腫瘤的SNR無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);腫瘤組織免疫組化及普魯士藍(lán)染色對(duì)比分析結(jié)果顯示，注射LYVE-1-PEG-USPIO組腫瘤組織邊緣部可見普魯士藍(lán)陽(yáng)性染色的淋巴管并可與免疫組化染色的淋巴管結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)，而注射PEG-USPIO組腫瘤組織內(nèi)未見普魯士藍(lán)陽(yáng)性染色的淋巴管。其他組織的普魯士藍(lán)染色結(jié)果顯示，除肝臟、脾臟及