美洲大蠊腸道內(nèi)生放線菌的多樣性研究.pdf

1、在細(xì)菌耐藥日趨嚴(yán)重的今天，加強(qiáng)新藥研發(fā)具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。放線菌是新型抗菌藥物的重要來(lái)源。長(zhǎng)期以來(lái)，研究放線菌天然藥物的重點(diǎn)多集中在土壤放線菌。但是，隨著土壤放線菌資源開(kāi)發(fā)利用日趨達(dá)到極限，從中發(fā)現(xiàn)新藥物或先導(dǎo)化合物的幾率大大降低，分離的活性代謝產(chǎn)物95％以上都是已知化合物。因此，拓寬放線菌研究領(lǐng)域，從不同來(lái)源的生物中尋找新的放線菌資源，是必由之路。自上世紀(jì)60年代起，海洋微生物和中藥植物內(nèi)生菌逐漸成為新藥研發(fā)的熱點(diǎn)。迄今為止，已從

2、中發(fā)現(xiàn)了近兩萬(wàn)種天然產(chǎn)物，而有關(guān)昆蟲微生物天然產(chǎn)物的研究只見(jiàn)零星報(bào)道。昆蟲是自然界最大的生物種群，約占全物種的85%以上，生命力非常頑強(qiáng)，大量?jī)?nèi)生菌與昆蟲互惠共生、協(xié)同進(jìn)化、抵抗致病菌入侵。美洲大蠊是傳統(tǒng)中藥材，具有抗菌、抗腫瘤、提高免疫力、保肝、促進(jìn)組織修復(fù)及抗炎、鎮(zhèn)痛等作用。美洲大蠊存在地球2億多年，仍生生不息，現(xiàn)已成為室內(nèi)的優(yōu)勢(shì)種群，主要生活在廚房、廁所、浴室及下水道等陰暗潮濕的環(huán)境。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)美洲大蠊藥理作用的研究越來(lái)越多，但有

3、關(guān)美洲大蠊內(nèi)生放線菌多樣性及其應(yīng)用方面的研究還較少。本文擬系統(tǒng)研究美洲大蠊腸道內(nèi)生放線菌的多樣性，為充分認(rèn)識(shí)其藥用價(jià)值和生物特性奠定基礎(chǔ)。
　　研究目的:
　　以野生美洲大蠊為研究對(duì)象，分離其腸道內(nèi)生放線菌。采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)等方法進(jìn)行初步分類鑒定及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，并對(duì)從美洲大蠊腸道分離得到的13株內(nèi)生戈登氏放線菌的生理生化特性進(jìn)行了初步研究。通過(guò)對(duì)美洲大蠊腸道內(nèi)生放線菌生物多樣性的研究，期望為新藥研發(fā)提供新的微生物資源

4、。
　　研究方法:
　　1.美洲大蠊腸道內(nèi)生放線菌的分離鑒定:
　　選擇適宜的抑菌劑，采用平板劃線稀釋法分離美洲大蠊腸道內(nèi)生放線菌。通過(guò)形態(tài)觀察、16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物Blast序列比對(duì)和DNAman6.0序列比對(duì)進(jìn)行初步的分類鑒定，運(yùn)用Mega5.1軟件，采用最大似然值法，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹對(duì)其進(jìn)行分析。
　　2.13株內(nèi)生戈登氏放線菌的生理生化特性研究
　　通過(guò)形態(tài)觀察、16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物Blast

5、序列比對(duì)和DNAman6.0序列比對(duì)13株戈登氏放線進(jìn)行分類鑒定，運(yùn)用Mega5.1軟件，采用最大似然值法，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹對(duì)其進(jìn)行分析。運(yùn)用GenBank中的BankIt軟件，申請(qǐng)13株戈登氏放線菌基因序列號(hào)。在此基礎(chǔ)上，以金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)、耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant staphylococcus aureus,MRSA)、大腸埃希

6、菌(Escherichia coli,E.coli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae,K.pneumonica)、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis,B.subtilis）等5種細(xì)菌和白色念珠菌(Candida albicans,C.albicans)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus,A.fumigatus)、黑曲霉（Aspergillus nige,A.nige）、紅色毛癬菌(

7、Trichophyton rubrum,T.rubrum)等4種真菌為供試菌，檢測(cè)13株內(nèi)生戈登氏放線菌發(fā)酵液的初步抑菌活性。并通過(guò)碳源利用實(shí)驗(yàn)、纖維素降解實(shí)驗(yàn)、淀粉降解實(shí)驗(yàn)、生物大分子降解實(shí)驗(yàn)、殺蟲劑主要活性成分降解實(shí)驗(yàn)和重金屬離子吸附實(shí)驗(yàn)等研究其理化性質(zhì)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.從13只美洲大蠊腸道中共分離得到了159株內(nèi)生放線菌，形態(tài)特征符合放線菌的經(jīng)典特征。16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物Blast序列比對(duì)結(jié)果顯示，159

8、株內(nèi)生放線菌分屬10個(gè)科，12個(gè)屬，其中鏈霉菌屬和戈登氏放線菌屬是優(yōu)勢(shì)菌屬，分別占分離總數(shù)的67.3%、8.2%。DNAman6.0序列比對(duì)結(jié)果顯示，149株放線菌與已知放線菌的相似度低于98.2%，占總分離菌株數(shù)的93.7%，可能是新菌株。
　　2.DNAman6.0序列比對(duì)結(jié)果顯示13株內(nèi)生戈登氏放線菌與已知菌株的相似性均低于98.2%，可能為新的菌種。經(jīng)申請(qǐng)，共有8株戈登氏放線菌的基因序列號(hào)。生理生化特性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，有4株

9、戈登氏放線菌的發(fā)酵液對(duì)S.aureus有抑制作用，4株對(duì)MRSA有抑制作用，4株對(duì)E.coli有抑制作用，8株對(duì)B.subtilis有抑制作用；3株對(duì)C.albicans有抑制作用，2株對(duì)T.rubrum有抑制作用，對(duì)K.pneumonica和A.fumigatus有抑制作用的只有1株，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)A.nige有抑制作用的菌株；13株戈登氏放線菌均能吸收利用葡萄糖和蔗糖，均不能吸收果糖和甘露糖，部分能吸收木糖、肌醇和鼠李糖；13株內(nèi)生戈登