新型磁響應(yīng)性脂肪酶的開(kāi)發(fā)及其催化合成生物柴油工藝的研究.pdf

1、在目前所研究的可再生清潔燃料中，生物柴油除了其可再生性及污染物排放少的優(yōu)良特性之外，還具有以下獨(dú)特之處:(1)可以與柴油進(jìn)行任意比例混勻但不影響柴油的物理性質(zhì);(2)可完全被生物降解;(3)可直接用于現(xiàn)有的柴油發(fā)動(dòng)機(jī)而不需對(duì)其進(jìn)行任何改動(dòng)。因此，良好的適應(yīng)性、安全性和經(jīng)濟(jì)性使生物柴油在眾多的可再生能源中脫穎而出，倍受科研工作者的廣泛關(guān)注。
　　在合成生物柴油的酯交換反應(yīng)中，酶催化轉(zhuǎn)化技術(shù)由于其良好的環(huán)境效應(yīng)而成為最有前景的生物柴油

2、合成方法。但現(xiàn)已開(kāi)發(fā)的酶催化法大多存在脂肪酶價(jià)格昂貴、催化效率低等問(wèn)題，使酶催化轉(zhuǎn)化技術(shù)往往不能同時(shí)兼顧生產(chǎn)成本及催化效率而難以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。因此，開(kāi)發(fā)價(jià)格低廉、催化效率高的脂肪酶并將其應(yīng)用于生物柴油的合成具有非常重要的意義。本論文針對(duì)目前存在的問(wèn)題，從脂肪酶的改造及生物柴油合成工藝的改進(jìn)入手，以提高酶催化活力、降低酶的生產(chǎn)成本，做了以下工作。
　　(1)借鑒固定化思想，采用共價(jià)偶聯(lián)法，在疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶(Thermomyce

3、s lanuginosus lipase，TLL)分子上偶聯(lián)納米Fe3O4-COOH顆粒制備得到磁響應(yīng)性脂肪酶(magnetic responsive lipases，MRL)，通過(guò)外加磁場(chǎng)實(shí)現(xiàn)了脂肪酶的分離回收并考察了影響MRL合成過(guò)程的因素。在最佳偶聯(lián)反應(yīng)條件下所制備得到的MRL其酶活力為23.02 U/mL，比活力為93.18 U/mg;雖然其酶活力僅相當(dāng)于純酶的31％，但比活力卻為純酶的128％。說(shuō)明經(jīng)過(guò)納米Fe3O4-COOH

4、顆粒的修飾后，單位脂肪酶所具有的催化活性提高了。同時(shí)，通過(guò)合理估算納米Fe3O4-COOH顆粒濃度及表面游離羧基濃度，大致知道每個(gè)納米Fe3O4顆粒表面約含160-170個(gè)可供反應(yīng)的羧基;通過(guò)MRL的蛋白質(zhì)含量，推測(cè)了MRL分子中納米顆粒與脂肪酶分子的個(gè)數(shù)比為8;通過(guò)TEM(Transmission electron microscope)圖像分析，考察了脂肪酶的引入對(duì)納米Fe3O4顆粒分散性的影響;通過(guò)對(duì)不同溶液中納米Fe3O4顆粒及

5、MRL粒子的Zeta電位測(cè)定，分析了納米Fe3O4顆粒的引入對(duì)增加所制備的MRL復(fù)合物在水溶液中穩(wěn)定性的作用。
　　(2)通過(guò)XRD(X-ray diffractometer)、AFM(Atomic force microscope)、FTIR(Fourier transform infrared microscope)、XPS(X-ray photoelectronspectroscopy)等表征手段對(duì)游離TLL和MRL的晶體結(jié)

6、構(gòu)、三維形貌、分子結(jié)構(gòu)及表面元素進(jìn)行了分析并預(yù)測(cè)了MRL的立體結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示經(jīng)納米Fe3O4-COOH顆粒的修飾合成了磁響應(yīng)脂肪酶，由于納米Fe3O4顆粒的存在而使酶的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，從對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，其α-螺旋的增加和β-折疊含量的降低使酶的分子結(jié)構(gòu)變得更加穩(wěn)定;并以催化橄欖油水解反應(yīng)考察了游離TLL和MRL的催化特性。與游離TLL相比，所制備的MRL具有更高的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性并且可以利用外加磁場(chǎng)進(jìn)行分

7、離回收，其操作穩(wěn)定性良好。
　　(3)確定了MRL催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)制備生物柴油的工藝。通過(guò)響應(yīng)性設(shè)計(jì)，充分考慮影響生物柴油合成過(guò)程中的主要因素，得到了其最優(yōu)制備工藝。在最優(yōu)制備工藝下:醇油摩爾比為4，分三次等量加入甲醇，酶用量為豆油質(zhì)量的9％，體系含水量為1.5％，反應(yīng)溫度為41℃，反應(yīng)28h后豆油轉(zhuǎn)化率為81.48±0.77％，是游離TLL的1.2倍;分析了游離TLL和MRL在生物柴油合成過(guò)程中的?；D(zhuǎn)移現(xiàn)象，微量水的存在導(dǎo)致了s

8、n-2位上?；霓D(zhuǎn)移，而且納米Fe3O4-COOH顆粒載體有利于sn-2位上酰基的轉(zhuǎn)移從而提高了MRL的酯交換率;考察了MRL制備生物柴油的操作穩(wěn)定性，MRL在重復(fù)使用10個(gè)批次后其大豆油轉(zhuǎn)化率和脂肪酸甲酯（fatty acid methylesters，F(xiàn)AMEs）得率僅降低了10.96％，說(shuō)明所制備的MRL的操作穩(wěn)定性好。與文獻(xiàn)相比，在獲得高轉(zhuǎn)酯化效率的同時(shí)，使酶的用量降低且實(shí)現(xiàn)了多次的重復(fù)使用。
　　(4)為進(jìn)一步提高脂肪酶

9、合成生物柴油的催化效率，首次采用共固定化技術(shù)將具有1，3位酯鍵專一性的MRL與無(wú)位置專一性的擴(kuò)展青霉脂肪酶(Penicillium expansum lipases，PEL)聯(lián)合制備了磁響應(yīng)性復(fù)合酶(magneticresponsive compound lipases，MRCL)，在最優(yōu)工藝條件下得到大豆油轉(zhuǎn)化率為97.87±0.51％，F(xiàn)AMEs得率為98.73±0.51％;與游離PEL和MRL相比，其轉(zhuǎn)化率分別提高了24.20％和