云芝細(xì)胞色素P450還原酶TvCPR和毛栓菌CYP酶ThCYP53--1在大腸桿菌中的表達(dá)及酶學(xué)特性分析.pdf

1、細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450，CYP)酶可能是最具催化作用多樣性的生物催化劑。白腐真菌能夠降解許多難降解有機(jī)污染物，除了其胞外木質(zhì)素降解酶系，其胞內(nèi)的細(xì)胞色素P450酶系(cytochrome P450s，CYPs)的降解功能也越來越引起人們的關(guān)注。白腐真菌可以依賴CYP酶系脫毒和降解環(huán)境中的各種外源化合物，如多環(huán)芳烴、酚類、固醇類和烷烴等化合物。毛栓菌Trametes hirsutaAH28-2與云芝Tramete

2、s versicolor都屬于白腐真菌。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)毛栓菌外加鄰甲苯胺誘導(dǎo)時其胞內(nèi)的CYP基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，表明毛栓菌的P450系統(tǒng)參與對外源芳香族化合物的響應(yīng)。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸-細(xì)胞色素P450還原酶(NADPH-cytochrome P450 reductase，CPR)是一類以FMN（黃素單核苷酸）和FAD（黃素腺嘌呤二核苷酸）為輔基的氧化還原酶，CPR是CYP的主要電子供體，與CYP的電子傳遞反應(yīng)是CYP氧化還原反應(yīng)的

3、限速步驟。
　　單獨表達(dá)、純化CPR和CYP，并對其進(jìn)行酶學(xué)特性的分析為體外構(gòu)建CYP酶反應(yīng)體系，研究CPR和不同家族的CYPs之間的相互作用，以及比較CPR和其它不依賴于CPR的CYP電子傳遞體（如細(xì)胞色素b5和NADH依賴的細(xì)胞色素b5還原酶）之間的差別奠定基礎(chǔ)。目前已有一些關(guān)于CPR在大腸桿菌中異源表達(dá)和功能鑒定的報道。為利于CPR在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)高效可溶性表達(dá)，通常的策略是對其N端膜結(jié)合的疏水區(qū)域進(jìn)行序列改造或者截除。真核

4、生物的CYP也是膜結(jié)合蛋白，通常也利用N端疏水區(qū)域替換或去除的策略實現(xiàn)其在大腸桿菌中的可溶且活性形式的表達(dá)。
　　本研究首先將云芝Trametes versicolor的全長CPR和去除預(yù)測的N端膜錨定區(qū)域（第1-24個氨基酸殘基）的CPR△24分別在大腸桿菌中異源表達(dá)，最終獲得可溶性表達(dá)的CPR△24蛋白，對該蛋白進(jìn)行純化，并對其酶學(xué)特性進(jìn)行分析，結(jié)果表明重組CPR△24的分子量與理論值78.35 kDa一致。鎳離子親和層析和分

5、子篩層析純化后測得其比活性為5.82 U/mg。酶學(xué)性質(zhì)分析顯示，CPR△24的最適溫度和pH分別為35℃和8.0，并對一些金屬離子及有機(jī)溶劑具有不同程度的耐受性。重組CPR△24在35℃和pH8.0反應(yīng)條件下對NADPH的動力學(xué)參數(shù)Km和kcat分別為19.7μM，3.31/s;對底物細(xì)胞色素c的動力學(xué)參數(shù)Km和kcat分別為25.9μM，10.2/s。
　　本研究其次將毛栓菌Trametes hirsuta AH28-2中的一