蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶PRMT6負(fù)向調(diào)節(jié)抗病毒天然免疫的效應(yīng)與機(jī)制研究.pdf

1、機(jī)體天然免疫系統(tǒng)(innate immune system)能夠識別和清除感染病原體，從而抵抗病原體感染與損傷。天然免疫系統(tǒng)主要由天然免疫細(xì)胞以及相關(guān)細(xì)胞通過模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）識別病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，啟動細(xì)胞內(nèi)天然免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，產(chǎn)生Ⅰ型干擾素(typeⅠinterferon，IFN

2、-Ⅰ)和促炎細(xì)胞因子，以抵抗病原體感染。
　　RIG-Ⅰ樣受體(RIG-Ⅰ-like receptors，RLRs)屬于PRRs中的一類關(guān)鍵受體，在細(xì)胞漿中識別RNA病毒，介導(dǎo)抗病毒天然免疫反應(yīng)，在機(jī)體天然免疫應(yīng)答中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。RIG-Ⅰ作為RLRs中的最關(guān)鍵的受體分子，可以通過識別RNA病毒或病毒復(fù)制中產(chǎn)物，通過接頭分子MAVS，活化TBK1-IRF3信號，激發(fā)IFN-Ⅰ產(chǎn)生，從而抵抗病毒感染。在RIG-Ⅰ發(fā)揮功能的過

3、程中，磷酸化修飾和泛素化修飾以及相關(guān)的酶分子發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，影響著RIG-Ⅰ信號的起始、傳遞和終止等進(jìn)程，進(jìn)而維持著機(jī)體的免疫平衡。基于我們前期對RIG-Ⅰ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究，我們通過IP-MS技術(shù)鑒定與RIG-Ⅰ相互作用的蛋白質(zhì)分子及其翻譯后修飾類型。通過分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)RIG-Ⅰ的相互作用分子中包括甲基轉(zhuǎn)移酶、乙?；D(zhuǎn)移酶、E3泛素連接酶、激酶/磷酸酶、代謝以及RNA修飾相關(guān)分子等，小鼠RIG-Ⅰ(mRIG-Ⅰ)的翻譯后

4、修飾類型包括甲基化、乙?；⒎核鼗?、磷酸化修飾等;其中，許多相互作用分子和翻譯后修飾在RIG-Ⅰ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的功能尚未知。我們對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了驗(yàn)證并克隆了mRIG-Ⅰ修飾位點(diǎn)的突變載體，開展了相關(guān)功能學(xué)研究。
　　蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶是一類在組織細(xì)胞中廣泛表達(dá)的酶分子，其主要包含9個家族分子，介導(dǎo)蛋白精氨酸殘基的甲基化修飾，參與調(diào)控多種細(xì)胞進(jìn)程，影響腫瘤、炎癥、代謝、DNA損傷修復(fù)等生命活動過程。隨著抗體開發(fā)技術(shù)和蛋白組學(xué)技術(shù)的

5、發(fā)展，PRMTs和精氨酸甲基化修飾的研究得以廣泛開展，但是其在天然免疫，尤其在抗病毒天然免疫中的功能還沒有相關(guān)報道。
　　在質(zhì)譜鑒定的RIG-Ⅰ的相互作用分子中，我們發(fā)現(xiàn)多個PRMTs家族的成員，提示PRMTs可能參與調(diào)節(jié)天然免疫應(yīng)答。我們克隆了PRMTs的9個分子，利用報告基因?qū)嶒?yàn)對PRMTs影響IFN-β表達(dá)的功能進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn)9個PRMTs分子都能調(diào)控IFN-β的表達(dá)，而PRMT6是其中抑制IFN-β表達(dá)效應(yīng)最顯著的分子。我

6、們還通過構(gòu)建PRMTs穩(wěn)定過表達(dá)的Raw264.7細(xì)胞株，用VSV病毒感染，發(fā)現(xiàn)PRMT6穩(wěn)定過表達(dá)可以顯著抑制病毒感染誘導(dǎo)的IFN-Ⅰ和IL-6的產(chǎn)生，相應(yīng)的IRF3活化也顯著低于對照。此外，在Raw264.7細(xì)胞、NIH3T3細(xì)胞和A549細(xì)胞中瞬時過表達(dá)PRMT6分子，再用病毒刺激，也獲得類似的結(jié)果。以上結(jié)果證實(shí)了PRMT6可以負(fù)向調(diào)節(jié)抗病毒天然免疫反應(yīng)。
　　為了檢測PRMT6的體內(nèi)效應(yīng)，我們構(gòu)建了Prmt6基因敲除小鼠。

7、首先，我們發(fā)現(xiàn)Prmt6缺失并不影響小鼠的正常生長發(fā)育和免疫系統(tǒng)的發(fā)育。通過VSV病毒感染同窩小鼠，我們發(fā)現(xiàn)，Prmt6缺失可以顯著提高小鼠的生存率。進(jìn)一步用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血清中細(xì)胞因子水平，發(fā)現(xiàn)Prmt6缺失小鼠血清中的IFN-α、IFN-β和IL-6顯著高于對照小鼠，相對應(yīng)的，Prmt6缺失小鼠的肝臟、脾臟和肺臟中VSV病毒的復(fù)制顯著低于對照。組

8、織學(xué)檢測肺部炎性細(xì)胞浸潤情況也顯示Prmt6缺失小鼠的肺部炎性細(xì)胞浸潤明顯低于對照小鼠。這些結(jié)果表明了Prmt6缺失可以顯著增強(qiáng)小鼠抵抗病毒感染的能力，證實(shí)了PRMT6負(fù)向調(diào)節(jié)抗病毒天然免疫反應(yīng)的功能。我們進(jìn)一步用RNA和DNA病毒分別刺激Prmt6缺失的BMDM細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)VSV病毒和HSV-1病毒刺激均能夠誘導(dǎo)Prmt6缺失的BMDM細(xì)胞產(chǎn)生更多的IFN-α、IFN-β和IL-6，這與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。我們進(jìn)一步分析了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

9、變化情況，發(fā)現(xiàn)Prmt6缺失可以顯著增強(qiáng)病毒誘導(dǎo)的RF3的活化，而不影響TBK1的磷酸化以及NF-κB和MAPK信號。這些結(jié)果說明了PRMT6通過抑制IRF3活化來抑制IFN-Ⅰ產(chǎn)生，從而抑制抗病毒天然免疫反應(yīng)。
　　體內(nèi)體外的結(jié)果明確了PRMT6負(fù)向調(diào)節(jié)抗病毒天然免疫反應(yīng)的功能，病毒感染是否會引起PRMT6表達(dá)水平和細(xì)胞定位的改變呢？我們利用Western Blot分析了病毒感染細(xì)胞的蛋白變化，發(fā)現(xiàn)病毒感染可以顯著上調(diào)小鼠和人巨

10、噬細(xì)胞中PRMT6的蛋白水平，同樣，病毒感染也可以引起人腫瘤細(xì)胞A549和HepG2中PRMT6的蛋白增加。與此同時，GDS5093、GDS1667和GDS2164中的公共數(shù)據(jù)也提示病毒感染可以上調(diào)PRMT6的表達(dá)，而且這種變化可能與病程密切相關(guān)。我們利用Western Blot檢測了巨噬細(xì)胞中PRMT6的胞漿胞核分布情況，發(fā)現(xiàn)PRMT6主要分布在細(xì)胞漿中，只有很少量的PRMT6分布于細(xì)胞核中，而且PRMT6的分布不隨病毒感染而改變。這

11、些結(jié)果與PRMT6通過調(diào)控IRF3磷酸化水平抑制IFN-Ⅰ產(chǎn)生的效應(yīng)相吻合。
　　PRMTs功能的發(fā)揮大多依賴其甲基轉(zhuǎn)移酶活性，PRMT6抑制抗病毒天然免疫反應(yīng)是否依賴其甲基轉(zhuǎn)移酶活性呢？我們根據(jù)已有的文獻(xiàn)信息，構(gòu)建了PRMT6的酶活性突變體PRMT6(dead)。通過報告基因?qū)嶒?yàn)，我們發(fā)現(xiàn)PRMT6可以顯著抑制TRIF、STING、RIG-Ⅰ-2CARD、MAVS、TBK1、IRF3-5D等誘導(dǎo)的IFN-β的表達(dá)，而PRMT6(

12、dead)并不能有效地逆轉(zhuǎn)PRMT6的抑制效應(yīng)。這些結(jié)果證實(shí)了PRMT6發(fā)揮其抑制抗病毒天然免疫的功能不依賴其酶活性，表現(xiàn)出與常規(guī)PRMTs不一樣的功能特征。接頭分子TRIF、STING、MAVS均可以通過TBK1-IRF3信號激活I(lǐng)FN-Ⅰ的產(chǎn)生，而我們的報告基因結(jié)果也證實(shí)了PRMT6可以顯著抑制TRIF、STING、MAVS誘導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生，這說明了PRMT6可能靶向TBK1-IRF3信號。進(jìn)一步的報告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果也證實(shí)了PR

13、MT6確實(shí)可以通過靶向TBK1-IRF3復(fù)合體來抑制IRF3活化，從而抑制IFN-β表達(dá)。結(jié)合前面Prmt6缺失可以增強(qiáng)IRF3磷酸化，但并不影響TBK1活化的結(jié)果，我們進(jìn)一步檢測PRMT6是否影響TBK1的激酶活性。通過體外激酶實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)PRMT6并不影響TBK1的激酶活性。以上結(jié)果證實(shí)了PRMT6靶向TBK1-IRF3復(fù)合體進(jìn)而抑制IRF3的活化，這一過程不依賴其甲基轉(zhuǎn)移酶活性，也不影響TBK1的激酶活性。
　　既然PRM

14、T6發(fā)揮其抑制抗病毒天然免疫的功能不依賴其酶活性，也不影響TBK1活化和TBK1的激酶活性，那么，PRMT6是否可以直接結(jié)合TBK1或者IRF3，從而抑制信號的傳遞呢？通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)PRMT6可以直接結(jié)合IRF3，而不結(jié)合TBK1、IKKε和IRF7。通過檢測內(nèi)源性的蛋白結(jié)合情況，發(fā)現(xiàn)在靜息的小鼠和人的巨噬細(xì)胞中，PRMT6可以結(jié)合IRF3，而當(dāng)病毒感染時，PRMT6與IRF3的結(jié)合增強(qiáng)。在Prmt6缺失的BMDM細(xì)胞中，

15、發(fā)現(xiàn)Prmt6缺失可以顯著促進(jìn)病毒誘導(dǎo)的TBK1與IRF3的結(jié)合，從而增強(qiáng)IRF3的活化。利用HEK293T細(xì)胞過表達(dá)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了PRMT6可以結(jié)合IRF3，從而阻斷TBK1與IRF3的結(jié)合，抑制IRF3磷酸化。研究結(jié)果表明，PRMT6可以結(jié)合IRF3，而且，在病毒感染時，PRMT6與IRF3的結(jié)合增強(qiáng)，從而阻斷TBK1與IRF3的結(jié)合，抑制IRF3的活化，使IFN-Ⅰ產(chǎn)生減少，抑制機(jī)體抗病毒天然免疫反應(yīng)。
　　我們進(jìn)一步根據(jù)PR

16、MT6的結(jié)構(gòu)域特征構(gòu)建了PRMT6的截短體表達(dá)載體，通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)PRMT6與IRF3的結(jié)合主要依賴其N端結(jié)構(gòu)域，而PRMT6發(fā)揮其抑制抗病毒天然免疫的功能則主要依賴其AA189-318結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)果也提示了PRMT6發(fā)揮功能可能依賴其N端結(jié)構(gòu)域結(jié)合IRF3，進(jìn)而通過空間位阻效應(yīng)阻礙TBK1與IRF3的結(jié)合，從而抑制IRF3活化和抗病毒天然免疫反應(yīng)。
　　綜上，在本研究中，我們鑒定了RIG-Ⅰ的相互作用分子和翻譯后修飾