灰蓋鬼傘漆酶在畢赤酵母中的異源表達(dá)及其酶學(xué)特性分析.pdf

1、漆酶(Laccase,苯二醇:氧氧化還原酶,EC l.10.3.2)是一種含銅的多酚氧化酶。其作用底物非常廣泛,能氧化大量的酚類或非酚類物質(zhì)。漆酶在造紙制漿、環(huán)境保護(hù)、能源領(lǐng)域、生物傳感器和生物檢測、食品工業(yè)和有機合成等方面具有非常高的潛在應(yīng)用價值。漆酶的這些應(yīng)用價值引起了越來越多的研究人員的興趣。但現(xiàn)階段漆酶主要來源于真菌的發(fā)酵,產(chǎn)量比較低,而且酶的活性也普遍不高,這些都限制了其大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用。通過對漆酶基因進(jìn)行改造,并異源高效表達(dá)

2、是解決這一問題的途徑之一。
　　在灰蓋鬼傘中有17個非等位漆酶基因已經(jīng)被克隆并測序,不過到目前為止只有幾個漆酶被純化和功能分析。本研究根據(jù)灰蓋鬼傘漆酶 LCC1的蛋白序列(GenBank:AAS38574.1)和畢赤酵母密碼偏愛設(shè)計了新的漆酶基因CCLCC1I,基因閱讀框長度為1578 bp,全長基因通過PTDS方法化學(xué)合成。采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對該基因進(jìn)行高效表達(dá),并研究重組漆酶的酶學(xué)特性和在降解染料方面的能力。
　　首先

3、根據(jù) LCC1蛋白序列和畢赤酵母密碼偏愛設(shè)計新的漆酶基因的核苷酸序列,再根據(jù)此序列設(shè)計一系列引物,用以合成目的基因。合成好的基因經(jīng)大腸桿菌克隆并測序,結(jié)果顯示基因序列與設(shè)計的完全一致。新的漆酶基因通過序列對比發(fā)現(xiàn)與原基因之間的核苷酸序列存在79.2％的同源性。
　　將測序正確的漆酶基因CCLCC1I連接到pPIC9K表達(dá)載體上,通過電轉(zhuǎn)法導(dǎo)入畢赤酵母細(xì)胞中,通過篩選獲得高酶活的重組酵母菌株。該重組菌在發(fā)酵4天后蛋白表達(dá)量達(dá)到最高,

4、為890 mg/L,遠(yuǎn)高于在A. oryzae中異源表達(dá)的8.0-135 mg/L。經(jīng)過硫酸銨分級沉淀和 Ni親和層析分離純化出單一的重組蛋白, SDS-PAGE電泳結(jié)果表明,其分子大小約為60 kDa,含糖量約為8%。酶學(xué)特性研究表明,重組漆酶的Km和Vmax值分別為0.136 mM和9,778μM min-1 mg-1。重組漆酶的最適 pH值為3.4,但在中性或堿性環(huán)境下更加穩(wěn)定,在 pH值小于3.4時重組漆酶的穩(wěn)定性極差,在4℃保

5、存24小時后,酶活僅剩6%,pH值為4.2時,剩余酶活迅速提高到74.1%。重組漆酶的最適溫度為40-45℃,在35-50℃之間,酶活性都非常高,超過50℃后,酶活隨溫度升高逐漸降低。重組漆酶的熱穩(wěn)定性比較好,在低于50℃時,非常穩(wěn)定;60℃溫育60分鐘后還剩余45.6%的酶活;當(dāng)溫度超過70℃后,重組漆酶的穩(wěn)定性急劇下降,溫育僅15℃后就只剩35.3%的酶活。Cu2+對重組漆酶沒有促進(jìn)作用,在10 mM時反而抑制重組漆酶的活性。重組漆

6、酶對Al3+,Fe3+,Fe2+,NaF和NaN3比較敏感,在10 mM濃度下, Al3+,Fe3+和NaF處理后漆酶的殘余活性僅剩27.1%,1.2%和33.9%。NaN3對重組漆酶的抑制效果極其明顯,在1 mM濃度下就能抑制其98.3%的活性,非常適宜作為漆酶反應(yīng)實驗的終止劑。Fe2+對重組漆酶的影響比較特殊,主要表現(xiàn)在,低濃度(0.1 mM)下促進(jìn)重組漆酶的活性,高濃度(0.2 mM)下抑制其酶活,在0.3 mM時,漆酶活性僅剩4

7、.5%。
　　對重組漆酶降解染料能力的研究發(fā)現(xiàn),漆酶不能直接降解結(jié)晶紫和孔雀石綠,但在ABTS的參與下,其降解能力大大提高。在含有0.05 mM的ABTS時,37℃處理60分鐘,CV和MG的降解率分別達(dá)到77.7%和79.2%。隨著ABTS濃度的增加,其降解速率會越快。
　　通過本實驗研究表明,經(jīng)過改造的漆酶基因能在畢赤酵母中高效表達(dá),而且重組漆酶CCLCC1I的表達(dá)量非常高,在中性和堿性環(huán)境穩(wěn)定性高,該漆酶的熱穩(wěn)定性也比較