旋毛蟲絲氨酸蛋白酶抑制因子的體外表達(dá)及膠體金免疫層析試紙條的研制.pdf

1、旋毛蟲（Trichinella spiralis）是一種重要的人畜共患食源性寄生蟲，對(duì)人和動(dòng)物均有明顯的致病性，能感染人和100多種哺乳動(dòng)物、鳥類及爬行動(dòng)物。該病呈世界性分布，人類疫病的暴發(fā)流行在不同的國(guó)家都常有報(bào)道，現(xiàn)已報(bào)道過的國(guó)家超過55個(gè)，其中不乏發(fā)達(dá)國(guó)家，目前，世界上估計(jì)超過1100萬人感染了旋毛蟲病。雖然阿苯達(dá)唑可以有效殺滅腸內(nèi)早期脫囊幼蟲、成蟲及移行期幼蟲，但由于該病臨床表現(xiàn)復(fù)雜，特別在感染早期或輕度感染時(shí)由于臨床癥狀并不典

2、型，容易被忽視或誤診，從而延誤救治時(shí)機(jī)而引起重大損失，因此對(duì)旋毛蟲病進(jìn)行準(zhǔn)確的診斷并及時(shí)治療是控制該病比較有效的方法。
　　 隨著蛋白質(zhì)技術(shù)及分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，及人們對(duì)檢測(cè)要求的提高，各種檢測(cè)技術(shù)不斷被研究開發(fā)，如PCR、ELISA、RIA等等，但也都存在一定的不足，特別是操作復(fù)雜及需要儀器輔助，限制了其應(yīng)用范圍。一步快速診斷試紙法是目前操作最簡(jiǎn)單、診斷最快的檢測(cè)技術(shù)，且診斷材料易于保存，敏感性和特異性亦均能滿足實(shí)驗(yàn)要求

3、，易于在基層推廣，是未來發(fā)展及應(yīng)用空間比較大的一種檢測(cè)方法。旋毛蟲絲氨酸蛋白酶抑制因子是一種蛋白酶抑制劑，是生物體主要的調(diào)節(jié)蛋白之一，在寄生蟲致病過程中起著重要作用。該基因在旋毛蟲各個(gè)發(fā)育時(shí)期都有表達(dá)，有望作為豬旋毛蟲病的候選診斷抗原。本研究的目的:(1)分析旋毛蟲絲氨酸蛋白酶抑制因子（Serpin）基因表達(dá)蛋白的抗原性;(2)利用該蛋白研制旋毛蟲膠體金免疫層析試紙條。
　　 根據(jù)GenBank中的旋毛蟲絲氨酸蛋白酶抑制因子(S

4、erpin)基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，擴(kuò)增目的基因片段，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a-ser，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21，以異丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)，并通過SDS-PAGE電泳及Western blot分析表達(dá)蛋白的大小及抗原性，同時(shí)篩選最佳純化條件。將純化后的蛋白免疫新西蘭兔，獲得抗Serpin的多克隆抗體，利用Western blot及ELISA法檢測(cè)多抗的特異性及效價(jià)，并用飽和硫酸銨沉淀法純化多抗IgG。結(jié)果顯示，

5、克隆得到的絲氨酸蛋白酶抑制因子基因約1.1kb，經(jīng)測(cè)序及分析，其完整的開放閱讀框?yàn)?122 bp，編碼373個(gè)氨基酸，與GenBank中的Serpin基因相對(duì)比，僅有一個(gè)堿基發(fā)生突變，相似性達(dá)99.9％，但編碼的氨基酸完全相同。將重組菌誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)SDS-PAGE分析，重組蛋白約為46.6 kD，用鎳瓊脂糖凝膠FF方法純化蛋白，以200 mM尿素洗滌時(shí)，得到比較純的蛋白。通過Western-blot方法對(duì)重組蛋白的抗原性進(jìn)行研究表明，

6、重組蛋白能被旋毛蟲感染150天的陽(yáng)性豬血清特異性識(shí)別，而與健康豬血清無反應(yīng)，說明具有良好的抗原性。得到的多克隆抗體，效價(jià)＞1(∶)51200，且具高特異性。
　　 本研究采用檸檬酸三鈉還原法制備20 nm的膠體金顆粒，并以膠體金標(biāo)記重組蛋白，用純化的多抗IgG及SPA在硝酸素纖維膜上分別包被C線及T線，采用雙抗原夾心法設(shè)計(jì)制備免疫層析試紙條。以制備的試紙條進(jìn)行血清檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)將陽(yáng)性豬血清稀釋到500倍依舊可檢到陽(yáng)性，且與豬瘟、豬藍(lán)