吡咯烷二硫代氨基甲酸酯對2型糖尿病大鼠胰島β細胞損傷的保護作用.pdf

1、糖尿病(diabetes mellitus，DM)已成為21世紀威脅人類生命健康的慢性重大疾病之一。隨著社會經(jīng)濟的快速發(fā)展，人民生活水平的不斷提高和生活方式的改變，糖尿病的發(fā)病率明顯提高。而2型糖尿病患者數(shù)量的激增是導(dǎo)致全世界糖尿病患者總數(shù)激增的主要原因。在我國糖尿病患者人數(shù)已位居世界第二位。糖尿病慢性并發(fā)癥如心腦血管疾病、糖尿病足、糖尿病腎病、糖尿病周圍神經(jīng)病變以及糖尿病視網(wǎng)膜病變糖尿病所引起的失明、截肢、尿毒癥等嚴重后果，不僅影響著

2、人類的健康及生活質(zhì)量，同時給社會也帶來了沉重的負擔(dān)。如何減輕2型糖尿病患者胰島β細胞氧化損傷及恢復(fù)β細胞功能及數(shù)量，仍是當(dāng)下治療糖尿病的難點及熱點。
　　在2型糖尿病的發(fā)病過程中，人體在高血糖和高脂肪酸的刺激下，產(chǎn)生大量氧自由基，引起氧化應(yīng)激是導(dǎo)致胰島β細胞功能損傷的主要原因。高濃度葡萄糖進入細胞內(nèi)使活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生增多，促發(fā)氧化應(yīng)激，啟動核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear fa

3、ctor ofκappaB，NF-κB)途徑，增加誘生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的轉(zhuǎn)錄和表達，使一氧化氮(NO)生成增加，過量的NO可與超氧陰離子(superoxide，O·2)迅速結(jié)合生成氧化作用更強的過氧亞硝基陰離子(peroxynitrite，ONOO-)，ONOO-對胰島β細胞有強烈的細胞毒性作用，可促進p細胞凋亡，ONOO-還可以硝化胰島素酪氨酸殘基并生成代謝物硝

4、基酪氨酸(nitrotyrosine，NT)，使胰島素結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，影響其生理作用。
　　如何恢復(fù)胰島β細胞功能和數(shù)量，促進胰島素分泌是2型糖尿病治療的關(guān)鍵。叉頭框蛋白O1(forkhead box O1，F(xiàn)oxO1)是一種調(diào)節(jié)胰島素合成的轉(zhuǎn)錄因子，是胰島素/胰島素樣生長因子-1(insulin/insulin-like growthfactors，INS/IGF-1)信號通路中的下游關(guān)鍵分子，受上游分子磷酸肌醇-3激酶/蛋

5、白激酶B(phosphatidylinositol3-kinase/protein kinas B，PI3k/Akt))磷酸化調(diào)控，與細胞的周期、凋亡、衰老以及代謝都有著密切的聯(lián)系。胰島十二指腸同源盒-1(pancreatic duodenal homeobox-1，PDX-1)是FoxO1下游的靶基因，它是胰島β細胞、γ細胞及分散在十二指腸的內(nèi)分泌細胞的轉(zhuǎn)錄因子。PDX-1基因的活化可以促進胰島素、生長抑素、葡萄糖激酶、葡萄糖轉(zhuǎn)運子2

6、及胰島淀粉樣多肽(glucagon-like peptide-1，GLP-1)等β細胞重要基因的表達。葡萄糖影響PDX-1的表達，可迅速激活PDX-1與DNA的結(jié)合，影響PDX-1磷酸化，調(diào)控PDX-1在細胞核和細胞漿之間的分布，參與胰島素基因的轉(zhuǎn)錄，對胰腺的發(fā)育、分化，胰島β細胞增殖及抑制凋亡等都有著極其重要的作用。
　　吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)為二硫氨基酸酯，因

7、其分子所含巰基(thiol)結(jié)構(gòu)，具有抗氧化及金屬螯合作用，可以抑制NF-κB活性，減少多種炎癥介質(zhì)的生成，從而減輕胰島β細胞的損傷。
　　本課題采用高脂飲食聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)腹腔注射的方法成功建立2型糖尿病大鼠模型，并經(jīng)PDTC(50mg/kg/d，IP)干預(yù)1周，通過對各組大鼠口服糖耐量與胰島素耐量實驗；胰腺組織中NF-κB表達、iNOS、NT水平及胰島β細胞凋亡情況。確定PDTC對糖

8、尿病大鼠的降糖作用及抗氧化應(yīng)激、抗硝基化反應(yīng)以及對胰腺β細胞損傷的保護作用。通過測定各組胰腺組織中胰島素含量，轉(zhuǎn)錄因子PDX-1的表達水平，以及FoxO1磷酸化，F(xiàn)oxO1乙?；剑接慞DTC促進胰島β細胞分泌胰島素的作用及其可能機制。本研究包括以下三部分：
　　第一部分吡咯烷二硫代氨基甲酸酯改善2型糖尿病大鼠胰島素抵抗
　　目的：探討PDTC改善2型糖尿病大鼠胰島素抵抗的作用。
　　方法：參照Reed等方法建立2

9、型糖尿病大鼠模型。8周齡健康雄性Wistar大鼠37只，體重180-210g。隨機分為正常對照組(NC組)12只和高脂飲食組(HFD組)25只，NC組以標(biāo)準大鼠飼料喂養(yǎng)，HFD組以高脂高糖飼料喂養(yǎng)。8周后經(jīng)口服葡萄糖耐量實驗(oral tolerance test，OGTT)和胰島素耐量實驗(insulin tolerance test，ITT)證實，高脂飲食喂養(yǎng)的大鼠出現(xiàn)胰島素抵抗后，給予一次性腹腔注射STZ(27mg/kg體重)，N

10、C組大鼠給予同等體積的檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射，72小時后內(nèi)眥靜脈取血測定血糖，以隨機血糖≥16.7mmol/L為2型糖尿病大鼠造模成功，共成功造模24只。將造模成功大鼠隨機分為糖尿病組(DM組)和PDTC治療組(DM+PDTC組)。PDTC治療組大鼠每日腹腔注射PDTC(50mg/kg)，NC組和DM組大鼠每日給予同等體積的生理鹽水腹腔注射。通過OGTT與ITT測定各組大鼠胰島素抵抗和胰島素敏感性。
　　結(jié)果：
　　1.高脂

11、喂養(yǎng)大鼠胰島素抵抗模型的建立
　　實驗第8周，通過對各組大鼠進行OGTT，可以看出，HFD組大鼠各時間點血糖水平均較NC組明顯升高，90min血糖達高峰，在2h左右時未能下降至正常水平；HFD組葡萄糖曲線下面積(area under the curve，AUC)明顯高于NC組有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。葡萄糖刺激后胰島素釋放功能結(jié)果顯示：HFD組大鼠各時間點胰島素分泌水平較NC組大鼠明顯升高，有顯著性差異(P<0.01)，HFD

12、組大鼠胰島素曲線下面積AUC明顯高于NC組，有顯著性差異(P<0.01)。胰島素耐量實驗顯示，HFD組各時間點血糖水平均高于NC組，胰島素耐量葡萄糖曲線下面積(AUC)HFD組明顯高于NC組，統(tǒng)計學(xué)有顯著性差異(P<0.01)。
　　2.PDTC改善2型糖尿病大鼠胰島素抵抗
　　PDTC治療1周后，再次行OGTT，可以看出，PDTC治療后大鼠各時間點血糖水平均明顯低于DM組大鼠，在2h左右時下降到接近正常水平，2h時間點血糖

13、水平與DM組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。葡萄糖刺激后胰島素釋放功能結(jié)果顯示：PDTC治療后大鼠各時間點胰島素分泌水平較DM組大鼠明顯降低，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。PDTC治療后大鼠葡萄糖曲線下面積AUC與胰島素曲線下面積AUC均無統(tǒng)計學(xué)差異。胰島素耐量結(jié)果顯示：PDTC治療組各時間點血糖水平明顯低于DM組，其中0min、15min、30min時間點有顯著性差異(P<0.01)，PDTC治療后大鼠胰島素耐量葡萄糖曲線下面積明顯

14、低于DM組大鼠，有顯著性差異(P<0.01)。從以上結(jié)果可以看出，PDTC治療后大鼠胰島素水平低于DM組大鼠，但PDTC治療后大鼠各時間點葡萄糖水平明顯低于DM組大鼠，說明PDTC可改善2型糖尿病大鼠胰島素抵抗，提高胰島素敏感性。
　　結(jié)論：
　　1.PDTC可降低大鼠血糖水平；
　　2.PDTC可改善2型糖尿病大鼠胰島素抵抗，提高胰島素敏感性。
　　第二部分吡咯烷二硫代氨基甲酸酯對2型糖尿病大鼠胰島β細胞氧化損

15、傷的保護作用
　　目的：測定各組大鼠胰腺組織中誘生型iNOS、NT及NF-κB的水平及胰島β細胞凋亡情況，探討PDTC對2型糖尿病大鼠胰島β細胞氧化損傷的保護作用及其機制。
　　方法：應(yīng)用免疫組化、免疫熒光染色和Western blot等方法檢測胰腺組織中iNOS及NT的生成水平及NF-κB在細胞核與細胞漿的分布情況；流式細胞術(shù)檢測胰島β細胞凋亡百分率。
　　結(jié)果：
　　1.PDTC對2型糖尿病大鼠胰島β細胞凋亡

16、的影響：DM組大鼠胰島β細胞凋亡率明顯高于NC組(P<0.01)；PDTC治療后大鼠胰島β細胞凋亡率明顯低于DM組(P<0.05)。
　　2.各組大鼠胰腺組織形態(tài)學(xué)變化：經(jīng)HE染色，顯微鏡下觀察可見，NC組胰腺胰島形態(tài)規(guī)則，胰島內(nèi)細胞數(shù)量較多，排列整齊，大小一致，分布均勻。DM組胰島結(jié)構(gòu)明顯破壞，胰島內(nèi)細胞數(shù)量明顯減少，分布稀疏，形態(tài)不規(guī)則，排列紊亂，可見空泡樣變。PDTC治療后大鼠胰島形態(tài)較糖尿病組胰島內(nèi)細胞明顯增多，細胞結(jié)構(gòu)明

17、顯改善。
　　3.各組胰腺組織中iNOS生成情況：iNOS免疫組化染色結(jié)果顯示：DM組大鼠胰腺β細胞胞質(zhì)中呈強陽性反應(yīng)，NC組大鼠胰腺組織中僅見較弱的iNOS陽性反應(yīng)信號，PDTC治療后大鼠胰腺組織iNOS陽性反應(yīng)細胞較糖尿病組明顯減少(P<0.01)；Western blot測定胰腺組織中iNOS表達：DM組大鼠胰腺組織中iNOS水平明顯高于NC組，PDTC治療后胰腺組織中iNOS水平明顯低于DM組(P<0.05)。
　　

18、4.各組胰腺組織中NT生成情況：NT免疫組化染色結(jié)果顯示：DM組大鼠胰腺β細胞胞質(zhì)中呈強陽性反應(yīng)，NC組大鼠胰腺組織中僅見較弱的NT陽性反應(yīng)信號，PDTC治療后大鼠胰腺組織NT陽性反應(yīng)細胞較糖尿病組明顯減少(P<0.01)：Western blot測定胰腺組織中NT表達：DM組大鼠胰腺組織中NT水平明顯高于NC組，PDTC治療后胰腺組織中NT水平明顯低于DM組(P<0.05)。
　　5.各組胰腺組織中NF-κB的生成及它在胰腺組織

19、細胞內(nèi)核漿分布情況：Western blot檢測結(jié)果顯示：DM組大鼠胰島細胞胞核內(nèi)NF-κB表達水平明顯高于NC組，PDTC治療后胰島細胞核內(nèi)NF-κB表達水平明顯降低(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.2型糖尿病大鼠胰腺組織中iNOS、ONOO-生成明顯增多，提示氧化應(yīng)激在糖尿病胰腺組織損傷中起重要作用；
　　2.PDTC可通過降低NF-κB轉(zhuǎn)錄活性，降低iNOS的表達及ONOO-的生成，減輕氧化應(yīng)激導(dǎo)致的糖尿病

20、大鼠胰島細胞的損傷。
　　第三部分吡咯烷二硫代氨基甲酸酯通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子PDX-1與FoxO1影響胰島β細胞合成胰島素
　　目的：通過測定各組大鼠胰腺組織中胰島素含量以及轉(zhuǎn)錄因子PDX-1、FoxO1磷酸化、FoxO1乙?；剑接慞DTC通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子PDX-1與FoxO1影響胰島β細胞合成胰島素的作用機制。
　　方法：應(yīng)用免疫組化染色方法測定胰腺組織胰島素的含量；Westernblot與免疫組化等方法檢測胰腺組

21、織中PDX-1表達，F(xiàn)oxO1乙?；剑约癙DX-1與FoxO1在胰島β細胞中核漿分布情況。
　　結(jié)果：
　　1.免疫組化觀察各組大鼠胰腺組織insulin的含量：NC對照組大鼠胰腺組織中insulin呈強陽性反應(yīng)，DM組大鼠胰腺組織中insulin陽性反應(yīng)信號明顯減低，PDTC治療后大鼠胰腺組織insulin陽性反應(yīng)細胞較糖尿病組明顯增多。
　　2.各組胰腺組織中PDX-1生成及其在胰島β細胞核漿中分布情況：免疫

22、組化觀察各組大鼠胰腺組織PDX-1的生成：NC組大鼠胰腺組織中PDX-1呈強陽性反應(yīng)，DM組大鼠胰腺組織中僅見較弱的PDX-1陽性反應(yīng)信號，PDTC治療后大鼠胰腺組織PDX-1陽性反應(yīng)細胞較糖尿病組明顯增多；激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，NC組大鼠胰島β細胞中PDX-1主要分布在細胞核內(nèi)；DM組大鼠胰島β細胞核內(nèi)僅見較弱的PDX-1陽性信號，PDTC治療組大鼠胰島β細胞中PDX-1也主要分布在細胞核內(nèi)；West-ern Blot檢測顯示：D

23、M組大鼠胰腺組織細胞核蛋白中PDX-1的表達量明顯低于NC組，PDTC治療后胰腺組織細胞核蛋白中PDX-1的表達量明顯高于DM組；DM組大鼠胰腺組織細胞漿蛋白中PDX-1的表達量明顯高于NC組，PDTC治療后胰腺組織細胞漿蛋白中PDX-1的表達量明顯低于DM組。以上結(jié)果提示PDTC可促進PDX-1從細胞漿轉(zhuǎn)位至細胞核。
　　3.各組胰腺組織中FoxO1磷酸化水平及其它在胰島β細胞中核漿分布情況：免疫組化觀察各組大鼠胰腺組織FoxO

24、1磷酸化水平：DM組大鼠胰腺組織中p-FoxO1呈強陽性反應(yīng)，NC組大鼠胰腺組織中僅見較弱的p-FoxO1陽性反應(yīng)信號，PDTC治療后大鼠胰腺組織p-FoxO1陽性反應(yīng)細胞較糖尿病組明顯減少；激光共聚焦顯微鏡觀察各組大鼠胰島β細胞FoxO1磷酸化水平：DM組大鼠胰島β細胞p-FoxO1主要分布在細胞核內(nèi)，NC組大鼠胰島β細胞核中僅見較弱的p-FoxO1陽性信號，PDTC治療后大鼠胰島β細胞胞核內(nèi)p-FoxO1陽性反應(yīng)信號較糖尿病組明顯減

25、少。
　　4.各組胰腺組織中FoxO1乙?；剑好庖呓M化觀察各組大鼠胰腺組織FoxO1乙酰化水平：DM組大鼠胰腺組織中呈強陽性反應(yīng)，NC組大鼠胰腺組織中僅見較弱的Ac-FoxO1陽性反應(yīng)信號，PDTC治療后大鼠胰腺組織Ac-FoxO1陽性反應(yīng)細胞較糖尿病組明顯減少；Western Blot檢測結(jié)果顯示：DM組大鼠胰腺組織中Ac-FoxO1的量明顯高于NC對照組，PDTC治療后胰腺組織中Ac-FoxO1的表達量明顯降低。