阿拉伯木聚糖溶解、降解機制的研究及酸性木聚糖酶基因的克隆、表達.pdf

1、大麥中的非淀粉多糖主要由阿拉伯木聚糖和β-葡聚糖組成，在過去的40多年，β-葡聚糖在制麥和釀造過程中的作用已得到研究者廣泛而深入的了解，但對阿拉伯木聚糖的研究確卻很少。最近研究者開始發(fā)現來源于谷物中的阿拉伯木聚糖會造成浸出率降低、麥汁粘度升高、過濾速度減慢、縮短濾膜壽命，甚至造成成品啤酒的渾濁。本文在研究了阿拉伯木聚糖測定方法的基礎上，調研了市售啤酒和啤酒用大麥中阿拉伯木聚糖的含量。系統(tǒng)的研究了糖化參數對阿拉伯木聚糖溶解的影響，運用數學

2、模型預測糖化醪中阿拉伯木聚糖濃度，并通過電子顯微鏡觀察了不同分子量的阿拉伯木聚糖對膜孔堵塞的情況。為了實現對釀造中阿拉伯木聚糖的酶法降解，對一株能產酸性木聚糖酶的真菌Aspergillussp.ZH-26進行鑒定后，優(yōu)化其產木聚糖酶的發(fā)酵條件和培養(yǎng)基組成，并嘗試了將Aspergillussp.ZH-26酸性木聚糖酶基因在大腸桿菌中進行克隆和表達。 本文通過建立糖腈乙酰化氣相色譜法測定啤酒(麥汁)中的阿拉伯木聚糖，測定了36種市售

3、啤酒中阿拉伯木聚糖的含量在479～1239mg/L，多聚阿拉伯木聚糖的含量在283～849mg/L。測定了36種國產主要啤用大麥中總阿拉伯木聚糖含量在3.50％～5.38％，而水溶性阿拉伯木聚糖含量在0.31％～0.67％。利用化學統(tǒng)計學的方法研究了啤酒中阿拉伯木聚糖、多聚阿拉伯木聚糖、β-葡聚糖的含量與啤酒原麥汁濃度、粘度、濁度之間的關系。結論如下：阿拉伯木聚糖和多聚阿拉伯木聚糖與粘度的相關系數分別為0.766和0.736，都要高于β

4、-葡聚糖與粘度的相關系數0.673。啤酒中阿拉伯木聚糖的含量顯著受原麥汁濃度的影響。 系統(tǒng)研究了釀造過程中阿拉伯木聚糖的溶解變化，及糖化溫度、谷物粉碎細度和機械攪拌等糖化參數對阿拉伯木聚糖溶解的影響。為了滿足廣大啤酒公司以小麥或小麥芽為輔料降低生產成本的需求，我們采用不同的輔料比、料水比和粉碎細度，在不同的糖化溫度下，研究了阿拉伯木聚糖的溶解對麥汁浸出率、麥汁粘度和麥汁過濾的影響。結果如下：麥汁和啤酒中的阿拉伯木聚糖主要來源于谷

5、物中水溶性的阿拉伯木聚糖，以大米為輔料時會降低麥汁和啤酒中阿拉伯木聚糖的含量，采用小麥或小麥芽代替輔料和代替麥芽時，隨輔料比的增加，阿拉伯木聚糖的含量增加，從而增加麥汁粘度，阻礙麥汁過濾。麥汁粘度受麥汁中水溶性阿拉伯木聚糖含量的影響要高于麥汁中β-葡聚糖含量對麥汁粘度的影響。糖化溫度能夠促進麥芽中水溶性阿拉伯木聚糖的浸出，不溶性的阿拉伯木聚糖在高溫作用下能夠轉變?yōu)闊崴扇苄缘陌⒗揪厶?。糖化機械攪拌顯著影響麥芽中阿拉伯木聚糖的溶解。

6、 通過構建熱力學和動力學方程，配合計算機模擬，建立了能夠模擬糖化過程中阿拉伯木聚糖的溶解和降解及麥芽內源內切木聚糖酶隨機進攻的數學模型，在給定不同的糖化曲線和初始麥芽條件的情況下能預測出最終糖化麥汁中阿拉伯木聚糖的濃度。在實驗室規(guī)模對此模型進行驗證，說明此模型能較準確的預測糖化麥汁中阿拉伯木聚糖的濃度。進一步將此模型在兩家啤酒公司進行驗證，模型誤差分別為16.8％和17.9％，說明此模型也能較為準確的反應實際生產的真實情況，為企業(yè)

7、預測阿拉伯木聚糖的風險問題和實現對糖化過程中阿拉伯木聚糖的在線檢測、控制提供了研究基礎。仿真實驗說明，通過在計算機上運行Matlab程序，運用建立的模型，我們可以快捷簡便的對糖化過程中阿拉伯木聚糖的溶解和降解進行預測研究。 為了研究阿拉伯木聚糖是否會對微孔濾膜產生堵塞，通過對小麥中阿拉伯木聚糖的分離、純化，得到分子量為102kDa、282kDa、389kDa和963kDa的阿拉伯木聚糖，并建立了評價阿拉伯木聚糖影響膜堵塞的評價體

8、系。通過建立多元回歸方程發(fā)現，對于未經剪切力作用的啤酒，研究發(fā)現F＞0.22比F＞0.45更容易受到阿拉伯木聚糖濃度的影響。經剪切力作用的啤酒與未經剪切力作用的啤酒相比，阿拉伯木聚糖的粒徑大小在剪切力作用下會顯著增加，而且被0.45μm膜截留的那部分阿拉伯木聚糖的比例顯著增加。高分子量的阿拉伯木聚糖在0.45μm和0.22μm膜上的粒徑分布與剪切力和乙醇濃度呈正相關。與0.22μm膜相比，被0.45μm膜截留的那部分阿拉伯木聚糖更容易受

9、乙醇濃度的影響，但不受pH值的影響。通過采用電子顯微鏡(SEM)手段，表征了阿拉伯木聚糖能夠堵塞啤酒的膜過濾，并且隨阿拉伯木聚糖分子量的增加膜堵塞情況更加嚴重。 阿拉伯木聚糖的酶解定量問題是一直困擾著釀造者開展木聚糖酶降解阿拉伯木聚糖研究的一大難題，過去所有的研究報道只是建立在利用粘度作為評價指標。我們通過提出多聚阿拉伯木聚糖(PAX)的概念用以指示高分子量部分的阿拉伯木聚糖，并被美國釀造學會采納，解決了阿拉伯木聚糖的酶解定量難

10、題。通過在全麥芽和以40％小麥芽為輔料的糖化初始掭加木聚糖酶，說明添加木聚糖酶能更多的溶解谷物中的阿拉伯木聚糖，使糖化醪中阿拉伯木聚糖含量升高，但能對PAX進行有效的降解，從而使經酶解后的小麥芽麥汁的粘度與全麥芽麥汁達到相當的水平，減輕糖化過濾困難的問題。進而利用響應面分析法，確定了糖化過程降解PAX的最優(yōu)條件為：木聚糖酶加酶量38U/g，糖化初始pH5.5，Ca2+離子濃度為114mg/L。驗證實驗證明，對不同比例的小麥芽為輔料進行糖

11、化，在優(yōu)化條件下加酶后麥汁粘度都能降低到1.44cP左右的水平，說明采用較高比例的小麥芽糖化時通過外加木聚糖酶的方法能夠消除阿拉伯木聚糖對麥汁粘度升高、影響過濾的問題。 為了實現對阿拉伯木聚糖的酶法降解，從一株分離得到的能產生酸性木聚糖酶的真菌Aspergillussp.ZH-26出發(fā)，通過對其形態(tài)特征和ITS保守區(qū)進行測序，對該菌進行鑒定，并在GenBank上申請登記，登記號為DQ235784。通過單因素實驗對Aspergil

12、lusawamoriZH-26產木聚糖酶的發(fā)酵條件進行研究，確定為：發(fā)酵初始pH4.0，30℃培養(yǎng)96h，裝液量為30％，搖瓶轉速為150r/min，接種量為1×106孢子/mL。通過Plackett-Burman多因素實驗設計法，對影響AspergillusawamoriZH-26產木聚糖酶的培養(yǎng)基組成進行了篩選，所選取的17個影響因素為：酵母膏、胰蛋白胨、尿素、NH4C1、(NH4)2SO4、NaNO3、KH2PO4、K2HPO4、

13、NH4NO3、MgSO4、CaCl2、CuSO4、ZnCl2、FeSO4、MnSO4、維生素B1、EDTA。方差分析表明，影響AspergillusawamoriZH-26產木聚糖酶的主要因素為酵母膏、胰蛋白胨、(NH4)2SO4、KH2PO4、CaCl2。進一步通過響應面分析法和典型性分析得出培養(yǎng)基最優(yōu)條件：酵母膏5.95g/L、胰蛋白胨6.79g/L、(NH4)2SO413.37g/L、KH2PO41.14g/L和CaCl20.81

14、g/L，預測木聚糖酶最大酶活Ymax=46.90U/mL。驗證性實驗證明在優(yōu)化條件下，AspergillusawamoriZH-26產木聚糖酶達47.26U/mL。 為了更好的研究酸性木聚糖酶的性質，以實現其潛在的工業(yè)化應用前景，我們從分子水平對其進行了研究。利用overlap-PCR技術，成功的克隆到了去除內含子的AspergillusawamoriZH-26酸性木聚糖酶(xynA)cDNA結構基因，將其接入到表達載體pTrc