人巨噬細(xì)胞抑制因子-1（MIC-1）在畢赤酵母中的優(yōu)化表達(dá)、蛋白純化及多克隆抗體的制備.pdf

1、目的：構(gòu)建人巨噬細(xì)胞抑制因子-1(MIC-1)優(yōu)化密碼子的表達(dá)載體，篩選穩(wěn)定的高表達(dá)MIC-1的酵母菌株，探索MIC-1重組蛋白的純化條件，并制備抗MIC-1多克隆抗體，為胰腺癌血清診斷試劑的研制奠定基礎(chǔ)。 方法：通過RT-PCR及基因克隆技術(shù)自人胎盤組織中獲得MIC-1 cDNA的全基因片段；通過PCR技術(shù)將MIC-1cDNA基因片段5’端的7個畢赤酵母非偏好密碼子定點(diǎn)突變?yōu)槠渫x優(yōu)越密碼子；構(gòu)建pPIC9K-mtMIC-1表

2、達(dá)載體，轉(zhuǎn)染并在畢赤酵母GS115工程菌中表達(dá)MIC-1重組蛋白，通過G418抗性篩選穩(wěn)定的MIC-1高表達(dá)菌株；研究不同表達(dá)條件對MIC-1重組蛋白表達(dá)量的影響；研究和初步建立MIC-1重組蛋白的純化方案及工藝；以純化的重組MIC-1蛋白為抗原免疫新西蘭白兔，制備抗MIC-1的多克隆抗體。 結(jié)果：成功克隆MIC-l cDNA，并構(gòu)建優(yōu)化密碼子的MIC-1重組蛋白表達(dá)載體；獲得穩(wěn)定的高表達(dá)重組蛋白畢赤酵母菌株，表達(dá)量約為30~5

3、0mg/L；初步建立了MIC-1重組蛋白中試發(fā)酵工藝；建立較完整的MIC-1重組蛋白的分離純化體系，純化所得重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測純度達(dá)90％以上；獲得抗MIC-1重組蛋白的多克隆抗血清，抗體效價(jià)為1：128,000。 結(jié)論：通過優(yōu)化密碼子的MIC-1重組蛋白表達(dá)載體，重組MIC-1畢赤酵母菌株的表達(dá)量顯著高于國際上其他單位該蛋白的表達(dá)水平；優(yōu)化了發(fā)酵、表達(dá)和純化工藝，重組蛋白純度達(dá)90％以上；以純化蛋白為抗原獲得了